Abstract This paper describes outcomes of the 2019 Cryo-EM Map-based Model Metrics Challenge sponsored by EMDataResource ( www.emdataresource.org ). The goals of this challenge were (1) to assess the quality of models that can be produced using current modeling software, (2) to check the reproducibility of modeling results from different software developers and users, and (3) compare the performance of current metrics used for evaluation of models. The focus was on near-atomic resolution maps with an innovative twist: three of four target maps formed a resolution series (1.8 to 3.1 Å) from the same specimen and imaging experiment. Tools developed in previous challenges were expanded for managing, visualizing and analyzing the 63 submitted coordinate models, and several novel metrics were introduced. The results permit specific recommendations to be made about validating near-atomic cryo-EM structures both in the context of individual laboratory experiments and holdings of structure data archives such as the Protein Data Bank. Our findings demonstrate the relatively high accuracy and reproducibility of cryo-EM models derived from these benchmark maps by 13 participating teams, representing both widely used and novel modeling approaches. We also evaluate the pros and cons of the commonly used metrics to assess model quality and recommend the adoption of multiple scoring parameters to provide full and objective annotation and assessment of the model, reflective of the observed density in the cryo-EM map.

Abstract Multi-resistant bacteria are a major threat in modern medicine. The gram-negative coccobacillus Acinetobacter baumannii currently leads the WHO list of pathogens in critical need for new therapeutic development. The maintenance of lipid asymmetry (MLA) protein complex is one of the core machineries that transport lipids from/to the outer membrane in gram-negative bacteria. It also contributes to broad-range antibiotic resistance in several pathogens, most prominently in A. baumannii . Nonetheless, the molecular details of its role in lipid transport has remained largely elusive. Here, we report the cryo-EM structures of the core MLA complex, MlaBDEF, from the pathogen A. baumannii , in the apo-, ATP- and ADB-bound states. These structures reveal multiple lipid binding sites, in the cytosolic and periplasmic side of the complex. Molecular dynamics simulations suggest their potential trajectory across the membrane. Collectively with the recently-reported structures of the E.coli orthologue, these data also allows us to propose a molecular mechanism of lipid transport by the MLA system.

Abstract Each year vast international resources are wasted on irreproducible research. The scientific community has been slow to adopt standard software engineering practices, despite the increases in high-dimensional data, complexities of workflows, and computational environments. Here we show how scientific software applications can be created in a reproducible manner when simple design goals for reproducibility are met. We describe the implementation of a test server framework and 40 scientific benchmarks, covering numerous applications in Rosetta bio-macromolecular modeling. High performance computing cluster integration allows these benchmarks to run continuously and automatically. Detailed protocol captures are useful for developers and users of Rosetta and other macromolecular modeling tools. The framework and design concepts presented here are valuable for developers and users of any type of scientific software and for the scientific community to create reproducible methods. Specific examples highlight the utility of this framework and the comprehensive documentation illustrates the ease of adding new tests in a matter of hours.

ABSTRACT Many metabolic enzymes self-assemble into micron-scale filaments to organize and regulate metabolism. The appearance of these assemblies often coincides with large metabolic changes as in development, cancer, and stress. Yeast undergo cytoplasmic acidification upon starvation, triggering the assembly of many metabolic enzymes into filaments. However, it is unclear how these filaments assemble at the molecular level and what their role is in the yeast starvation response. CTP Synthase (CTPS) assembles into metabolic filaments across many species. Here, we characterize in vitro polymerization and investigate in vivo consequences of CTPS assembly in yeast. Cryo-EM structures reveal a pH-sensitive assembly mechanism and highly ordered filament bundles that stabilize an inactive state of the enzyme, features unique to yeast CTPS. Disruption of filaments in cells with non-assembly or hyper-assembly mutations decreases growth rate, reflecting the importance of regulated CTPS filament assembly in homeotstasis.

ABSTRACT Building accurate protein models into moderate resolution (3-5Å) cryo-electron microscopy (cryo-EM) maps is challenging and error-prone. While the majority of solved cryo-EM structures are at these resolutions, there are few model validation metrics that can precisely evaluate the local quality of atomic models built into these maps. We have developed MEDIC (Model Error Detection in Cryo-EM), a robust statistical model to identify residue-level errors in protein structures built into cryo-EM maps. Trained on a set of errors from obsoleted protein structures, our model draws off two major sources of information to predict errors: the local agreement of model and map compared to expected, and how “native-like” the neighborhood around a residue looks, as predicted by a deep learning model. MEDIC is validated on a set of 28 structures that were subsequently solved to higher-resolutions, where our model identifies the differences between low- and high-resolution structures with 68% precision and 60% recall. We additionally use this model to rebuild 12 deposited structures, fixing 2 sequence registration errors, 51 areas with improper secondary structure, 51 incorrect loops, and 16 incorrect carbonyls, showing the value of this approach to guide model building.

Abstract Cryo-electron microscopy of protein complexes often leads to moderate resolution maps (4-8 Å), with visible secondary structure elements but poorly resolved loops, making model-building challenging. In the absence of high-resolution structures of homologues, only coarse-grained structural features are typically inferred from these maps, and it is often impossible to assign specific regions of density to individual protein subunits. This paper describes a new method for overcoming these difficulties that integrates predicted residue distance distributions from a deep-learned convolutional neural network, computational protein folding using Rosetta, and automated EM-map-guided complex assembly. We apply this method to a 4.6 Å resolution cryoEM map of Fanconi Anemia core complex (FAcc), an E3 ubiquitin ligase required for DNA interstrand crosslink repair, which was previously challenging to interpret as it is comprised of 6557 residues, only 1897 of which are covered by homology models. In the published structure built from this map, only 387 residues could be assigned to specific subunits. By building and placing into density 42 deep-learning guided models containing 4795 residues not included in the previously published structure, we are able to determine an almost-complete atomic model of FAcc, in which 5182 of the 6557 residues were placed. The resulting model is consistent with previously published biochemical data, and facilitates interpretation of disease related mutational data. We anticipate that our approach will be broadly useful for cryoEM structure determination of large complexes containing many subunits for which there are no homologues of known structure.

The actin protein fold is found in cytoskeletal polymers, chaperones, and various metabolic enzymes. Many actin-fold proteins, like the carbohydrate kinases, do not polymerize. We find that Glk1, a Saccharomyces cerevisiae glucokinase, forms two-stranded filaments with unique ultrastructure, distinct from that of cytoskeletal polymers. In cells, Glk1 polymerizes upon sugar addition and depolymerizes upon sugar withdrawal. Glk1 polymerization inhibits its enzymatic activity, thus the Glk1 monomer-polymer equilibrium sets a maximum rate of glucose phosphorylation regardless of Glk1 concentration. A mutation eliminating Glk1 polymerization alleviates concentration-dependent enzyme inhibition, causing glucokinase activity to become unconstrained. Polymerization-based regulation of Glk1 activity serves an important function in vivo : yeast containing non-polymerizing Glk1 are less fit when growing on sugars and more likely to die when refed glucose. Glucokinase polymerization arose within the ascomycete fungi and is conserved across a group of divergent (150-200 mya) yeast. We show that Glk1 polymerization arose independently from other actin-related filaments and allows yeast to rapidly modulate glucokinase activity as nutrient availability changes.One-sentence summary Yeast glucokinase activity is limited by its polymerization, which is critical for cell viability during glucose refeeding.

Rubicon is a potent negative regulator of autophagy and a potential target for autophagy-inducing therapeutics. Rubicon-mediated inhibition of autophagy requires the interaction of the C-terminal Rubicon homology (RH) domain of Rubicon with Rab7-GTP. Here we report the 2.8 Angstrom crystal structure of the Rubicon RH domain in complex with Rab7-GTP. Our structure reveals a novel fold for the RH domain built around four zinc clusters. The switch regions of Rab7 insert into pockets on the surface of the RH domain in a mode that is distinct from those of other Rab-effector complexes. Rubicon residues at the dimer interface are required for Rubicon and Rab7 to colocalize in living cells. Mutation of Rubicon RH residues in the Rab7 binding site restore efficient autophagic flux in the presence of overexpressed Rubicon, validating the Rubicon RH domain as a promising therapeutic target.### Competing Interest StatementJ.H.H. is a co-founder of Casma Therapeutics.

To achieve a single fully harmonised research data set suitable for analysis from data collected at multiple sites requires not only semantic integration of collection concepts and convergence onto single collection units, but harmonisation of data collection processes. We describe our experience of identifying harmonisation challenges in the Precision ALS project, with particular focus on process alignment challenges in a multi-site multi-national research data collection project.

The bacterial flagellum is a remarkable molecular motor, present at the surface of many bacteria, whose primary function is to allow motility through the rotation of a long filament protruding from the bacterial cell. A cap complex, consisting of an oligomeric assembly of the protein FliD, is localized at the tip of the flagellum, and is essential for filament assembly, as well as adherence to surfaces in some bacteria. However, the structure of the intact cap complex, and the molecular basis for its interaction with the filament, remains elusive. Here we report the cryo-EM structure of the Campylobacter jejuni cap complex. This structure reveals that FliD is pentameric, with the N-terminal region of the protomer forming an unexpected extensive set of contacts across several subunits, that contribute to FliD oligomerization. We also demonstrate that the native C. jejuni flagellum filament is 11-stranded and propose a molecular model for the filament-cap interaction.