The functional role of heteromers of G-protein-coupled receptors is a matter of debate. In the present study, we demonstrate that heteromerization of adenosine A 1 receptors (A 1 Rs) and A 2A receptors (A 2A Rs) allows adenosine to exert a fine-tuning modulation of glutamatergic neurotransmission. By means of coimmunoprecipitation, bioluminescence and time-resolved fluorescence resonance energy transfer techniques, we showed the existence of A 1 R–A 2A R heteromers in the cell surface of cotransfected cells. Immunogold detection and coimmunoprecipitation experiments indicated that A 1 R and A 2A R are colocalized in the same striatal glutamatergic nerve terminals. Radioligand-binding experiments in cotransfected cells and rat striatum showed that a main biochemical characteristic of the A 1 R–A 2A R heteromer is the ability of A 2A R activation to reduce the affinity of the A 1 R for agonists. This provides a switch mechanism by which low and high concentrations of adenosine inhibit and stimulate, respectively, glutamate release. Furthermore, it is also shown that A 1 R–A 2A R heteromers constitute a unique target for caffeine and that chronic caffeine treatment leads to modifications in the function of the A 1 R–A 2A R heteromer that could underlie the strong tolerance to the psychomotor effects of caffeine.

Antagonistic and reciprocal interactions are known to exist between adenosine and dopamine receptors in the striatum. In the present study, double immunofluorescence experiments with confocal laser microscopy showed a high degree of colocalization of adenosine A(2A) receptors (A(2A)R) and dopamine D(2) receptors (D(2)R) in cell membranes of SH-SY5Y human neuroblastoma cells stably transfected with human D(2)R and in cultured striatal cells. A(2A)R/D(2)R heteromeric complexes were demonstrated in coimmunoprecipitation experiments in membrane preparations from D(2)R-transfected SH-SY5Y cells and from mouse fibroblast Ltk(-) cells stably transfected with human D(2)R (long form) and transiently cotransfected with the A(2A)R double-tagged with hemagglutinin. Long term exposure to A(2A)R and D(2)R agonists in D(2)R-cotransfected SH-SY5Y cells resulted in coaggregation, cointernalization and codesensitization of A(2A)R and D(2)R. These results give a molecular basis for adenosine-dopamine antagonism at the membrane level and have implications for treatment of Parkinson's disease and schizophrenia, in which D(2)R are involved.

The possible molecular basis for the previously described antagonistic interactions between adenosine A 1 receptors (A 1 R) and dopamine D 1 receptors (D 1 R) in the brain have been studied in mouse fibroblast Ltk − cells cotransfected with human A 1 R and D 1 R cDNAs or with human A 1 R and dopamine D 2 receptor (long-form) (D 2 R) cDNAs and in cortical neurons in culture. A 1 R and D 1 R, but not A 1 R and D 2 R, were found to coimmunoprecipitate in cotransfected fibroblasts. This selective A 1 R/D 1 R heteromerization disappeared after pretreatment with the D 1 R agonist, but not after combined pretreatment with D 1 R and A 1 R agonists. A high degree of A 1 R and D 1 R colocalization, demonstrated in double immunofluorescence experiments with confocal laser microscopy, was found in both cotransfected fibroblast cells and cortical neurons in culture. On the other hand, a low degree of A 1 R and D 2 R colocalization was observed in cotransfected fibroblasts. Pretreatment with the A 1 R agonist caused coclustering (coaggregation) of A 1 R and D 1 R, which was blocked by combined pretreatment with the D 1 R and A 1 R agonists in both fibroblast cells and in cortical neurons in culture. Combined pretreatment with D 1 R and A 1 R agonists, but not with either one alone, substantially reduced the D 1 R agonist-induced accumulation of cAMP. The A 1 R/D 1 R heteromerization may be one molecular basis for the demonstrated antagonistic modulation of A 1 R of D 1 R receptor signaling in the brain. The persistence of A 1 R/D 1 R heteromerization seems to be essential for the blockade of A 1 R agonist-induced A 1 R/D 1 R coclustering and for the desensitization of the D 1 R agonist-induced cAMP accumulation seen on combined pretreatment with D 1 R and A 1 R agonists, which indicates a potential role of A 1 R/D 1 R heteromers also in desensitization mechanisms and receptor trafficking.

Abstract Often, in vitro or in vivo enzyme-mediated catalytic events occur far from equilibrium and, therefore, substrate affinity measured as the inverse of ES ⇄ E+S dissociation equilibrium constant ( K d ) has a doubtful physiological meaning; in practice it is almost impossible to determine K d (except using stopped-flow or other sophisticated methodologies). The Michaelis-Menten constant ( K m ), the concentration of substrate ([S]) providing half of enzyme maximal activity, is not the ( K d ). In the simple E+S ⇄ ES → E+P or in more complex models describing S conversion into P, K m must be considered the constant defining the steady state at any substrate concentration. Enzyme kinetics is based on initial rate determination, i.e. in the linear part of the S to P conversion when the concentration of [ES] remains constant while steady state occurs. We also show that Systems Biology issues such as the time required to respond to a system perturbation, is more dependent on k 1 , the kinetic constant defining substrateenzyme association, than on K m . Whereas K m is instrumental for biochemical basic and applied approaches, in any physiological condition, an important parameter to be considered is the substrate association rate ( k 1 ).

Early Huntington's disease (HD) include over-activation of dopamine D1 receptors (D1R), producing an imbalance in dopaminergic neurotransmission and cell death. To reduce D1R over-activation, we present a strategy based on targeting complexes of D1R and histamine H3 receptors (H3R). Using an HD striatal cell model and HD organotypic brain slices we found that D1R-induced cell death signaling and neuronal degeneration , are mitigated by an H3R antagonist. We demonstrate that the D1R-H3R heteromer is expressed in HD animal models at early but not late stages of HD, correlating with HD progression. In accordance, we found this target expressed in human control subjects and low-grade HD patients. Finally, treatment of HD mice with an H3R antagonist prevented cognitive and motor learning deficits, as well as the loss of heteromer expression. Taken together, our results indicate that D1R-H3R heteromers play a pivotal role in dopamine signaling and represent novel targets for treating HD.

Abstract Cereblon/CRBN is a substrate-recognition component of the Cullin4A-DDB1-Roc1 E3 ubiquitin ligase complex. Destabilizing mutations in the human CRBN gene cause a form of autosomal recessive non-syndromic intellectual disability (ARNSID) that is modelled by knocking-out the mouse Crbn gene. A reduction in excitatory neurotransmission has been proposed as an underlying mechanism of the disease, but the intimate factors eliciting this impairment remain mostly unknown. Here we report that CRBN molecules selectively located on glutamatergic neurons are necessary for proper memory function. Combining various in vivo approaches, we show that the cannabinoid CB 1 receptor (CB 1 R), a key suppressor of synaptic transmission, is overactivated in CRBN deficiency-linked ARNSID mouse models, and that the memory deficits observed in these animals can be rescued by acute CB 1 R-selective pharmacological antagonism. Molecular studies demonstrated that CRBN interacts physically with CB 1 R and impairs the CB 1 R-G i/o -cAMP-PKA pathway in a ubiquitin ligase-independent manner. Taken together, these findings unveil that CB 1 R overactivation is a driving mechanism of CRBN deficiency-linked ARNSID and anticipate that the blockade of CB 1 R could constitute a new therapy for this orphan disease.