Abstract Pathogenic mycobacteria actively dysregulate protective host immune signalling pathways during infection to drive the formation of permissive granuloma microenvironments. Dynamic regulation of host microRNA (miRNA) expression is a conserved feature of mycobacterial infections across host-pathogen pairings. Here we examine the role of miR-206 in the zebrafish model of Mycobacterium marinum infection, which allows investigation of the early stages of granuloma formation. We find miR-206 is upregulated following infection by pathogenic M. marinum and that antagomir-mediated knockdown of miR-206 is protective against infection. We observed striking upregulation of cxcl12a and cxcr4b in infected miR-206 knockdown zebrafish embryos and live imaging revealed enhanced recruitment of neutrophils to sites of infection. We used Crispr/Cas9-mediated knockdown of cxcl12a and cxcr4b expression and AMD3100 inhibition of Cxcr4 to show that the enhanced neutrophil response and reduced bacterial burden caused by miR-206 knockdown was dependent on the Cxcl12/Cxcr4 signalling axis. Together, our data illustrate a pathway through which pathogenic mycobacteria induce host miR-206 expression to suppress Cxcl12/Cxcr4 signalling and prevent protective neutrophil recruitment to granulomas. Author summary Mycobacterial infections cause significant disease burden to humans and animals, the most widely known example being tuberculosis which has killed more humans than any other infectious disease throughout history. Infectious mycobacteria are highly evolved to hijack host processes, including the very immune cells tasked with destroying them. microRNAs are host molecules that control wide-ranging programs of host gene expression and are important in the immune response to infections. Here we use the zebrafish model of mycobacterial infection to determine the role of the infection-induced microRNA miR-206 in the host response to infection. We found pathogenic mycobacteria trigger the host to produce more miR-206 in order to suppress the otherwise protective recruitment of neutrophils to sites of infection via the host Cxcl12/Cxcr4 signalling pathway. Our study provides new insight into the role of mycobacterial infection-induced miR-206 function in the context of a whole host.

Abstract Heme oxygenase function is highly conserved between vertebrates where it plays important roles in normal embryonic development and controls oxidative stress. Expression of the zebrafish heme oxygenase 1 genes are known to be responsive to oxidative stress suggesting a conserved physiological function. Here we generate a knockout allele of zebrafish hmox1a and characterize the effects of hmox1a and hmox1b loss on embryonic development. We find that loss of hmox1a or hmox1b causes developmental defects in only a minority of embryos, in contrast to Hmox1 gene deletions in mice that causes loss of most embryos. Using a tail wound inflammation assay we find a conserved role for hmox1a , but not hmox1b , in normal macrophage migration to the wound site. Together our results indicate zebrafish hmox1a has clearly a partitioned role from hmox1b that is more consistent with conserved functions of mammalian Heme oxygenase 1.

Abstract Gut dysbiosis is an important modifier of pathologies including cardiovascular disease but our understanding of the role of individual microbes is limited. Here, we have used transplantation of mouse microbiota into microbiota-deficient zebrafish larvae to study the interaction between members of a mammalian high fat diet-associated gut microbiota with a lipid rich diet challenge in a tractable model species. We find zebrafish larvae are more susceptible to hyperlipidaemia when exposed to the mouse high fat-diet-associated microbiota and that this effect can be driven by two individual bacterial species fractionated from the mouse high fat-diet-associated microbiota. We find Stenotrophomonas maltophilia increases the hyperlipidaemic potential of chicken egg yolk to zebrafish larvae independent of direct interaction between S. maltophilia and the zebrafish host. Colonisation by live, or exposure to heat-killed, Enterococcus faecalis accelerates hyperlipidaemia via host Myd88 signalling. The hyperlipidaemic effect is replicated by exposure to the Gram positive Toll-like receptor agonists peptidoglycan and lipoteichoic acid in a MyD88-dependent manner. In this work, we demonstrate the applicability of zebrafish as a tractable host for the identification of gut microbes that can induce conditional host phenotypes via microbiota transplantation and subsequent challenge with a high fat diet.

Abstract Short chain fatty acids (SCFAs) are produced by microbial fermentation of dietary fiber in the gut. Butyrate is a particularly important SCFA with anti-inflammatory properties and is generally present at lower levels in inflammatory diseases associated with gut microbiota dysbiosis in mammals. We aimed to determine if SCFAs are produced by the zebrafish microbiome and if SCFAs exert conserved effects on zebrafish immunity as an example of the non-mammalian vertebrate immune system. We demonstrate that bacterial communities from adult zebrafish intestines synthesize all three main SCFA in vitro , although SCFA were below our detectable limits in zebrafish intestines in vivo . Immersion in butyrate, but not acetate or propionate, reduced the recruitment of neutrophils and M1-type pro-inflammatory macrophages to wounds. We found conservation of butyrate sensing by neutrophils via orthologs of the hydroxycarboxylic acid receptor 1 ( hcar1 ) gene. Neutrophils from Hcar1-depeleted embryos were no longer responsive to the anti-inflammatory effects of butyrate, while macrophage sensitivity to butyrate was independent of Hcar1. Our data demonstrate conservation of anti-inflammatory butyrate effects and identify the presence of a conserved molecular receptor in fish.

ABSTRACT Hyperglycaemia damages the microvasculature in part through the reduced recruitment of immune cells and interference with platelet signalling, leading to poor wound healing and accelerated lipid deposition in mammals. We investigated the utility of zebrafish larvae to model the effect of glucose on neutrophil and macrophage recruitment to a tail wound, wound-induced haemostasis, and chicken egg yolk feed challenge-induced hyperlipidaemia by supplementing larvae with exogenous glucose by immersion or injection. Neither method of glucose supplementation affected the recruitment of neutrophils and macrophages following tail transection. Glucose injection reduced thrombocyte retention and fibrin plug formation while only thrombocyte retention was reduced by glucose immersion following tail transection. We observed accelerated lipid accumulation in glucose-injected larvae challenged with high fat chicken egg yolk feeding. Our study identifies conserved and divergent effects of high glucose on inflammation, haemostasis, and hyperlipidaemia in zebrafish larvae compared to mammals.

ABSTRACT The constant exposure of the fish branchial cavity to aquatic pathogens must have driven local mucosal immune responses to be extremely important for their survival. In this study, we used a universal marker for T lymphocytes/natural killer cells (ZAP70) and advanced imaging techniques to investigate the lymphoid architecture of the zebrafish branchial cavity. We identified a new lymphoid organ, which we tentatively named “Nemausean Lymphoid Organ” (NEMO), situated below the pharynx, and closely associated with gill lymphoid tissues. Besides T/NK cells, NEMO is enriched in plasma/B cells and antigen-presenting cells embedded in a network of reticulated epithelial cells. Presence of activated T cells and lymphocyte proliferation but not V(D)J recombination or hematopoiesis, suggests a function as secondary lymphoid organ. In response to infection, NEMO displays structural changes including the formation of T/NK cells clusters. NEMO and gill lymphoid aggregates form a cohesive unit within a lymphoid network that extends throughout the pharyngo-respiratory area. Collectively, our findings reveal a new mucosal lymphoid organ reminiscent of mammalian tonsils that evolved in fish. Importantly, NEMO could clearly be identified in multiple teleost fish families. One sentence summary A previously unreported lymphoid organ has been identified within the pharyngo-respiratory tract of the zebrafish, and other teleost fish, providing new insights into the immune system of teleost fish and the evolution of vertebrate immunology.

Abstract Infections caused by Mycobacterium abscessus are increasing in prevalence within patient groups with respiratory comorbidities. Initial colonisation by the smooth colony M. abscessus (S) can be followed by an irreversible genetic switch into a highly inflammatory rough colony M. abscessus (R), often associated with a decline in pulmonary function. Our understanding of the role of adaptive immunity in M. abscessus pathogenesis is largely unknown. Here, we have used intraperitoneal infection of adult zebrafish to model M. abscessus pathogenesis in the context of fully functioning host immunity. We find infection with the R variant penetrates host organs causing an inflammatory immune response leading to necrotic granuloma formation within 2 weeks. The R bacilli are targeted by T cell-mediated immunity and burden is constrained. Strikingly, the S variant colonises host internal surfaces at high loads and is met with a robust innate immune response but little T cell-mediated immunity. Invasive granuloma formation is delayed in S variant infection compared to R variant infection upon which T cell-mediated immunity is required to control infection. In mixed infections, the S variant outcompetes the R variant. We also find the R variant activates host immunity to the detriment of S variant M. abscessus in mixed infections. These findings demonstrate the applicability of the adult zebrafish to model persistent M. abscessus infection and provide insight into the immunopathogenesis of chronic M. abscessus infection.

Abstract Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) causes urinary tract infections that can result in sepsis. The haemostatic system is protective in the pyelonephritis stage of ascending UPEC infection, but the role of the haemostatic system has not been investigated during sepsis. Here we utilize a zebrafish-UPEC systemic infection model to visualize infection-induced coagulation and examine the effects of commonly prescribed anti-haemostatic medications on the infection severity. Treatment of systemically infected zebrafish with warfarin, aspirin, or ticagrelor reduced host survival, while stabilization of clots with aminocaproic acid increased host survival. Anti-haemostatic drug treatment increased UPEC burden. Our findings provide evidence that commonly prescribed anti-haemostatic medications may worsen the outcome of severe UPEC infection.

Summary Pathogenic mycobacteria inhibit inflammasome activation as part of their pathogenesis. While it is known that potassium efflux is a trigger for inflammasome activation, the interaction between mycobacterial infection, potassium efflux and inflammasome activation has not been investigated. Here we use Mycobacterium marinum infection of zebrafish embryos and Mycobacterium tuberculosis of human THP-1 cells to demonstrate that pathogenic mycobacteria upregulate the host WNK signalling pathway kinases SPAK and OXSR1 which control intracellular potassium balance. We show that genetic depletion or inhibition of OXSR1 decreases bacterial burden and intracellular potassium levels. The protective effects of OXSR1 depletion are mediated by NLRP3 inflammasome activation and are dependent on caspase-mediated release of IL-1β and the downstream activation of protective TNF-α. The elucidation of this druggable pathway to potentiate inflammasome activation provides a new avenue for the development of host-directed therapies against intracellular infections.

Abstract Regulation of host microRNA (miRNA) expression is a contested node that controls the host immune response to mycobacterial infection. The host must overcome concerted subversive efforts of pathogenic mycobacteria to launch and maintain a protective immune response. Here we examine the role of miR-126 in the zebrafish model of Mycobacterium marinum infection and identify a protective role for this infection-induced miRNA through multiple effector pathways. Specifically, we analyse the impact of the miR-126 knockdown-induced tsc1a and cxcl12a/ccl2/ccr2 signalling axes during early host- M . marinum interactions. We find a strong detrimental effect of tsc1a upregulation that renders zebrafish embryos susceptible to higher bacterial burden and increased cell death despite dramatically higher recruitment of macrophages to the site of infection. We demonstrate that infection-induced miR-126 suppresses tsc1 and cxcl12a expression thus improving macrophage function early in infection, partially through activation of mTOR signalling and strongly through preventing the recruitment of Ccr2+ permissive macrophages, resulting in the recruitment of protective tnfa -expressing macrophages. Together our results demonstrate an important role for infection-induced miR-126 in shaping an effective immune response to M . marinum infection in zebrafish embryos.