Abstract A self-cleaving ribozyme mapping to an intron of the cytoplasmic polyadenylation element binding protein 3 ( CPEB3 ) gene has been suggested to play a role in human episodic memory, but the underlying mechanisms mediating this effect are not known. The ribozyme’s self-scission half-life matches the time it takes an RNA polymerase to reach the immediate downstream exon, suggesting that the ribozyme-dependent intron cleavage is tuned to co-transcriptional splicing of the CPEB3 mRNA. Here we report that the murine ribozyme modulates its own host mRNA maturation in both cultured cortical neurons and the hippocampus. Inhibition of the ribozyme using an antisense oligonucleotide leads to increased CPEB3 protein expression, which enhances polyadenylation and translation of localized plasticity-related target mRNAs, and subsequently strengthens hippocampal-dependent long-term memory. These findings reveal a previously unknown role for self-cleaving ribozyme activity in regulating experience-induced co-transcriptional and local translational processes required for learning and memory.

Optogenetic tools have revolutionized the study of receptor-mediated biological processes, but such tools are lacking for the study of RNA-controlled systems. To fill this gap, we used in vitro selection to isolate a novel RNA that selectively binds the trans isoform of a stiff-stilbene (amino- t SS), a rapidly and reversibly photoisomerizing small molecule. Structural probing revealed that the RNA binds amino- t SS about 100-times stronger than amino- c SS, giving the system robust selectivity for the trans isomer. In vitro and in vivo functional analysis showed that the riboswitch, termed Werewolf-1 (Were-1), inhibits translation of a downstream open reading frame when bound to amino- t SS and photoisomerization of the ligand with a sub-millisecond pulse of light induced the protein expression. Similarly, bacterial culture containing the cis isoform (amino- c SS) supported protein expression, which was inhibited upon photoisomerization to amino- t SS. Reversible regulation of gene expression using a genetically encoded light-responsive RNA will broaden the analysis of complex RNA processes in living cells.

Abstract A self-cleaving ribozyme that maps to an intron of the cytoplasmic polyadenylation element binding protein 3 ( CPEB3 ) gene is thought to play a role in human episodic memory, but the underlying mechanisms mediating this effect are not known. We tested the activity of the murine sequence and found that the ribozyme’s self-scission half-life matches the time it takes an RNA polymerase to reach the immediate downstream exon, suggesting that the ribozyme-dependent intron cleavage is tuned to co-transcriptional splicing of the CPEB3 mRNA. Our studies also reveal that the murine ribozyme modulates maturation of its harboring mRNA in both cultured cortical neurons and the hippocampus: inhibition of the ribozyme using an antisense oligonucleotide leads to increased CPEB3 protein expression, which enhances polyadenylation and translation of localized plasticity-related target mRNAs, and subsequently strengthens hippocampal-dependent long-term memory. These findings reveal a previously unknown role for self-cleaving ribozyme activity in regulating experience-induced co-transcriptional and local translational processes required for learning and memory. Significance Statement Cytoplasmic polyadenylation-induced translation is one of the key steps for regulating protein synthesis and neuroplasticity in the hippocampus. The CPEB3 ribozyme is a highly conserved mammalian self-cleaving catalytic RNA with unknown biological roles. In this study, we investigated how the intronic ribozyme affects the CPEB3 mRNA maturation and translation, and its subsequent effect on memory formation. Our findings show that the ribozyme activity is anti-correlated with CPEB3 mRNA splicing: inhibition of the ribozyme results in higher mRNA and protein levels, which contribute to long-term memory. Our studies offer new insights into the role of the CPEB3 ribozyme in neuronal translational control for the activity-dependent synaptic functions that underlie long-term memory and demonstrate a novel biological role for self-cleaving ribozymes.

Abstract Prior to the emergence of the contemporary biosphere, the early Earth is likely to have progressed through an RNA-based world. In such an evolving world, it would have been critical to have a system of genome replication that allowed heritable information to be transferred with an early catalyst, such as an RNA polymerase ribozyme. Though substantial effort has gone into evolving such a polymerase, many variants suffer from premature termination and low fidelity, resulting in low yields of full-length sequences and small quantities of active sequences, respectively. The ability to replicate and maintain a genome at a higher fidelity would lend an evolutionary advantage to an early evolvable system. Cells today achieve this through a variety of means, including complex damage repair mechanisms and proofreading pathways, but such dedicated machinery would likely not exist in an early evolving world. However, if an early polymerase possessed repair activity under specific conditions, replication would have been improved. Here we demonstrate the first example of ribozyme-mediated repair of damaged and mismatched RNA sequences. Under conditions of high pyrophosphate concentrations, we show that a polymerase ribozyme can repair RNA sequences terminated in a 2′ −3′ cyclic phosphate, a mismatch, or both, to allow further polymerization along a template. In many cases, the fidelity of the repaired RNA extension is significantly higher than priming from a mismatched base-pair; this observation suggests that mutations may have an allosteric effect on the fidelity of downstream replication. Finally, we show that the pyrophosphorolysis reaction directly yields a nucleoside triphosphate, providing the first evidence for ribozyme-catalyzed production of ATP. Increased fidelity and processivity of polymerization advances the longstanding goal of developing a self-replicating polymerase ribozyme.

Abstract Objective Currently, diagnosis of cerebrospinal fluid (CSF) rhinorrhea relies on a multimodal approach, increasing costs and ultimately delaying diagnosis. In the United States and internationally, the crux of such a diagnosis relies on confirmation testing (via biomarkers) and localization (e.g., imaging). Biomarker testing may require analysis at an outside facility, resulting in delays diagnosis and treatment. In addition, specialized imaging may be nonspecific and often requires an active leak for diagnosis. There remains a clear need for innovative new technology. Methods A comprehensive review was conducted on both foundational and innovative scholarly articles regarding current and emerging diagnosis modalities for CSF. Results Current modalities in CSF rhinorrhea diagnosis and localization include laboratory tests (namely, B2T immunofixation), imaging (CT and/or MRI) with or without intrathecal administration, and surgical exploration. Each of these modalities carry flaws, risks, and benefits, ultimately contributing to delays in diagnosis and morbidity. Promising emerging technologies include lateral flow immunoassays (LFI) and biologically functionalized field‐effect transistors (BioFET). Nevertheless, these carry some drawbacks of their own, and require further validation. Conclusion CSF rhinorrhea remains a challenging diagnosis, requiring a multimodal approach to differentiate from nonpathologic causes of rhinorrhea. Current methods in diagnosis are imperfect, as the ideal test would be a readily accessible, inexpensive, rapid, highly accurate point‐of‐care test without the need for excess fluid or specialized processing. Critical work is being done to develop promising, new, improved tests, though a clear successor has not yet emerged. Level of Evidence N/A

RNA sequences encode structures that impact protein production and other cellular processes. Misfolded RNAs can also potentiate disease, but a complete picture is lacking. To establish more comprehensive and accurate RNA structure–function relationships, new methods are needed to interrogate RNA in native environments. Existing tools rely primarily on electrophiles that are constitutively "on" or triggered by UV light, often resulting in high background. Here we describe an alternative, chemically triggered approach to cross-link RNAs using bioorthogonal cyclopropenones (CpOs). These reagents selectively react with phosphines to provide ketenes─electrophiles that can trap neighboring nucleophiles to forge covalent cross-links. As a proof-of-concept, we conjugated a CpO motif to thiazole orange (TO-1). TO-1–CpO bound selectively to a model RNA aptamer (Mango) with nanomolar affinity, as confirmed by fluorescence turn-on. After phosphine administration, covalent cross-links were formed between the CpO and RNA. Cross-linking was both time and dose dependent. We further applied the chemically triggered tools to model RNAs under biologically relevant conditions. Collectively, this work expands the toolkit of probes for studying RNA and its native conformations.

Abstract A complete understanding of RNA biology requires methods for tracking transcripts in vivo . Common strategies rely on fluorogenic probes that are limited in sensitivity, dynamic range, and depth of interrogation, owing to their need for excitation light and tissue autofluorescence. To overcome these challenges, we developed a bioluminescent platform for serial imaging of RNAs. Small RNA tags were engineered to recruit light-emitting luciferase fragments (termed RNA lanterns) upon transcription. Robust photon production was observed for RNA targets both in cells and in live animals. Importantly, only a single copy of the tag was necessary for sensitive detection, in sharp contrast to fluorescent platforms requiring multiple repeats. Overall, this work provides a foundational platform for visualizing RNA dynamics from the micro to the macro scale.