Abstract The vinegar fly Drosophila melanogaster is a pivotal model for invertebrate development, genetics, physiology, neuroscience, and disease. The whole family Drosophilidae, which contains over 4000 species, offers a plethora of cases for comparative and evolutionary studies. Despite a long history of phylogenetic inference, many relationships remain unresolved among the groups and genera in the Drosophilidae. To clarify these relationships, we first developed a set of new genomic markers and assembled a multilocus data set of 17 genes from 704 species of Drosophilidae. We then inferred well-supported group and species trees for this family. Additionally, we were able to determine the phylogenetic position of some previously unplaced species. These results establish a new framework for investigating the evolution of traits in fruit flies, as well as valuable resources for systematics.

Abstract The compound eyes of insects exhibit striking variation in size, reflecting adaptation to different lifestyles and habitats. However, the genetic and developmental bases of variation in insect eye size is poorly understood, which limits our understanding of how these important morphological differences evolve. To address this, we further explored natural variation in eye size within and between four species of the Drosophila melanogaster species subgroup. We found extensive variation in eye size among these species, and flies with larger eyes generally had a shorter inter-ocular distance and vice versa . We then carried out quantitative trait loci (QTL) mapping of intra-specific variation in eye size and inter-ocular distance in both D. melanogaster and D. simulans. This revealed that different genomic regions underlie variation in eye size and inter-ocular distance in both species, which we corroborated by introgression mapping in D. simulans . This suggests that although there is a trade-off between eye size and inter-ocular distance, variation in these two traits is likely to be caused by different genes and so can be genetically decoupled. Finally, although we detected QTL for intra-specific variation in eye size at similar positions in D. melanogaster and D. simulans , we observed differences in eye fate commitment between strains of these two species. This indicates that different developmental mechanisms and therefore, most likely, different genes contribute to eye size variation in these species. Taken together with the results of previous studies, our findings suggest that the gene regulatory network that specifies eye size has evolved at multiple genetic nodes to give rise to natural variation in this trait within and among species.

Abstract The compound eyes of insects exhibit extensive variation in ommatidia number and size, which affects how they see and underlies adaptations in their vision to different environments and lifestyles. However, very little is known about the genetic and developmental bases underlying differences in compound eye size. We previously showed that the larger eyes of Drosophila mauritiana compared to D. simulans is caused by differences in ommatidia size rather than number. Furthermore, we identified an X-linked chromosomal region in D. mauritiana that results in larger eyes when introgressed into D. simulans . Here, we used a combination of fine-scale mapping and gene expression analysis to further investigate positional candidate genes on the X chromosome. We found that orthodenticle is expressed earlier in D. mauritiana than in D. simulans during ommatidial maturation in third instar larvae, and we further show that this gene is required for the correct organisation and size of ommatidia in D. melanogaster . Using ATAC-seq, we have identified several candidate eye enhancers of otd as well as potential direct targets of this transcription factor that are differentially expressed between D. mauritiana and D. simulans . Taken together, our results suggest that differential timing of otd expression contributes to natural variation in ommatidia size between D. mauritiana and D. simulans , which provides new insights into the mechanisms underlying the regulation and evolution of compound eye size in insects.

Abstract The paradigm of differentiation in southern refugia during glacial periods followed by expansions during interglacials, producing limited genetic diversity and population sub-division in northern areas, dominates European phylogeography. However, the existence of complex structured populations in formerly glaciated areas, and on islands connected to mainland areas during glacial maxima, call for alternative explanations. Here, we reconstruct the mtDNA phylogeography of the widespread Polyommatus icarus butterfly over its native range, with an emphasis on the formerly glaciated and connected British Isles. We found distinct geographical structuring of CO 1 mitotypes, with an ancient lineage restricted to the marginal European areas, including Northern Scotland and Outer Hebrides. We detected perfect mtDNA- Wolbachia associations in Northern Britain that support the possibility of at least two post-glacial Wolbachia -mediated sweeps, suggesting a series of sequential replacement of mtDNA in the British Isles and potentially in Europe. Population genomic analysis, using ddRADSeq genomic markers, also reveal unexpected genetic structuring within Britain. However, weak mito-nuclear concordance suggests the potential for independent histories of nuclear versus mitochondrial genomes. We found clustering of genomic SNPs of French samples, with respect to those in the British Isles, is not consistent with a scenario of a single recolonisation. Taken together our mtDNA and ddRADseq observations are consistent with a history of at least two distinct colonisations, a phylogeographic scenario previously put forth to explain diversity and structuring in other British flora and fauna. Additionally, we also present preliminary evidence that Wolbachia- induced feminization may be occurring in the isolated population in the Outer Hebrides.

Convergent phenotypic evolution is often caused by recurrent changes at particular nodes in the underlying gene regulatory networks (GRNs). The genes at such evolutionary 'hotspots' are thought to maximally affect the phenotype with minimal pleiotropic consequences. This has led to the suggestion that if a GRN is understood in sufficient detail, the path of evolution may be predictable. The repeated evolutionary loss of larval trichomes among Drosophila species is caused by the loss of shavenbaby (svb) expression. svb is also required for development of leg trichomes, but the evolutionary gain of trichomes in the 'naked valley' on T2 femurs in Drosophila melanogaster is caused by the loss of microRNA-92a (miR-92a) expression rather than changes in svb. We compared the expression and function of components between the larval and leg trichome GRNs to investigate why the genetic basis of trichome pattern evolution differs in these developmental contexts. We found key differences between the two networks in both the genes employed, and in the regulation and function of common genes. These differences in the GRNs reveal why mutations in svb are unlikely to contribute to leg trichome evolution and how instead miR-92a represents the key evolutionary switch in this context. Our work shows that variability in GRNs across different developmental contexts, as well as whether a morphological feature is lost versus gained, influence the nodes at which a GRN evolves to cause morphological change. Therefore, our findings have important implications for understanding the pathways and predictability of evolution.

Abstract In the last 240,000 years, males of the Drosophila simulans species clade have evolved striking differences in the morphology of their epandrial posterior lobes and claspers (surstyli). These changes have most likely been driven by sexual selection and mapping studies indicate a highly polygenic and generally additive genetic basis. However, we have limited understanding of the gene regulatory networks that control the development of genital structures and how they evolved to result in this rapid phenotypic diversification. Here, we used new D. simulans / D. mauritiana introgression lines on chromosome 3L to generate higher resolution maps of posterior lobe and clasper differences between these species. We then carried out RNA-seq on the developing genitalia of both species to identify the genes expressed during this process and those that are differentially expressed between the two species. This allowed us to test the function of expressed positional candidates during genital development in D. melanogaster . We identified several new genes involved in the development and possibly the evolution of these genital structures, including the transcription factors Hairy and Grunge. Furthermore, we discovered that during clasper development Hairy negatively regulates tartan , a gene known to contribute to divergence in clasper morphology. Taken together our results provide new insights into the regulation of genital development and how this evolves between species.

Male genital structures are among the most rapidly evolving morphological traits and are often the only features that can distinguish closely related species. This process is thought to be driven by sexual selection and may reinforce species separation. However, while the genetic basis of many phenotypic differences have been identified, we still lack knowledge about the genes underlying evolutionary differences in male genital organs and organ size more generally. The claspers (surstyli) are periphallic structures that play an important role in copulation in insects. Here we show that natural variation in clasper size and bristle number between Drosophila mauritiana and D. simulans is caused by evolutionary changes in tartan (trn) , which encodes a transmembrane leucine-rich repeat domain protein that mediates cell-cell interactions and affinity differences. There are no fixed amino acid differences in trn between D. mauritiana and D. simulans but differences in the expression of this gene in developing genitalia suggest cis-regulatory changes in trn underlie the evolution of clasper morphology in these species. Finally, analysis of reciprocal hemizyotes that are genetically identical, except for which species the functional allele of trn is from, determined that the trn allele of D. mauritiana specifies larger claspers with more bristles than the allele of D. simulans . Therefore we have identified the first gene underlying evolutionary change in the size of a male genital organ, which will help to better understand the rapid diversification of these structures and the regulation and evolution of organ size more broadly.Significance Statement The morphology of male genital organs evolves rapidly driven by sexual selection. However, little is known about the genes underlying genitalia differences between species. Identifying these genes is key to understanding how sexual selection acts on development to produce rapid phenotypic change. We have found that the gene tartan underlies differences between male Drosophila mauritiana and D. simulans in the size and bristle number of the claspers - genital projections that grasp the female during copulation. Moreover, since tartan encodes a protein that is involved in cell affinity, this may represent a new developmental mechanism for morphological change. Therefore, our study provides new insights into genetic and developmental bases for the rapid evolution of male genitalia and organ size more generally.

Summary The emergence and subsequent diversification of morphological novelties is a major feature of animal evolution 1–9 . However, in most cases little is known about the molecular basis of the evolution of novel structures and the genetic mechanisms underlying their diversification. The epandrial posterior lobes of the male genital arch is a novelty of some species of the Drosophila melanogaster subgroup 10–13 . The posterior lobes grasp the ovipositor of the female and then integrate between her abdominal tergites, and therefore these structures are important for copulation and species-recognition 10–12,14–17 . The posterior lobes evolved from co-option of a Hox regulated gene network from the posterior spiracles 10 and have since diversified in shape and size in the D. simulans clade in particular over the last 240,000 years driven by sexual selection 18–21 . The genetic basis of this diversification is highly polygenic but to the best of our knowledge none of the causative genes have yet been identified despite extensive mapping 22–30 . Identifying the genes underlying the diversification of these secondary sexual structures is essential to understanding the basis of changes in their morphology and the evolutionary impact on copulation and species recognition. Here, we show that the transcription factor encoded by Sox21b negatively regulates posterior lobe size during development. This is consistent with higher and expanded expression of Sox21b in D. mauritiana , which develops smaller posterior lobes compared to D. simulans . We tested this by generating reciprocal hemizygotes and confirmed that changes in Sox21b underlie posterior lobe evolution between these two species. Furthermore, we found that differences in posterior lobe size caused by the species-specific allele of Sox21b significantly affect the duration of copulation. Taken together, our study reveals the genetic basis for the sexual selection driven diversification of a novel morphological structure and its functional impact on copulatory behaviour. Highlights Sox21b regulates the development of the epandrial posterior lobes, a recently evolved novel structure of some species of the Drosophila melanogaster subgroup, which has subsequently rapidly diversified in size and shape. D. mauritiana has smaller posterior lobes than D. simulans and more expansive expression of Sox21b in the developing genitalia. Using a reciprocal hemizygosity test, we show that variation in Sox21b underlies the diversification of epandrial posterior lobe size and shape between D. simulans and D. mauritiana . Behavioural tests show that the species allele of Sox21b causes differences in the duration of copulation in otherwise genetically identical backgrounds. Sox21b has evolved between D. simulans and D. mauritiana , and contributed to the divergence of a morphological novelty and copulatory behaviour between these two species.