Abstract The auxin-inducible degradation system in C. elegans allows for spatial and temporal control of protein degradation via heterologous expression of a single Arabidopsis thaliana F-box protein, transport inhibitor response 1 (AtTIR1). In this system, exogenous auxin (Indole-3-acetic acid; IAA) enhances the ability of AtTIR1 to function as a substrate recognition component that adapts engineered degron-tagged proteins to the endogenous C. elegans E3 ubiquitin ligases complex [SKR-1/2-CUL-1-F-box (SCF)], targeting them for degradation by the proteosome. While this system has been employed to dissect the developmental functions of many C. elegans proteins, we have found that several auxin-inducible degron (AID)-tagged proteins are constitutively degraded by AtTIR1 in the absence of auxin, leading to undesired loss-of-function phenotypes. In this manuscript, we adapt an orthogonal auxin derivative/mutant AtTIR1 pair [C. elegans AID version 2 (C.e.AIDv2)] that transforms the specificity of allosteric regulation of TIR1 from IAA to one that is dependent on an auxin derivative harboring a bulky aryl group (5-Ph-IAA). We find that a mutant AtTIR1(F79G) allele that alters the ligand-binding interface of TIR1 dramatically reduces ligand-independent degradation of multiple AID*-tagged proteins. In addition to solving the ectopic degradation problem for some AID-targets, the addition of 5-Ph-IAA to culture media of animals expressing AtTIR1(F79G) leads to more penetrant loss-of-function phenotypes for AID*-tagged proteins than those elicited by the AtTIR1-IAA pairing at similar auxin analog concentrations. The improved specificity and efficacy afforded by the mutant AtTIR1(F79G) allele expand the utility of the AID system and broaden the number of proteins that can be effectively targeted with it.

Abstract Condensins are molecular motors that compact DNA via linear translocation. In C. elegans , the X-chromosome harbors a specialized condensin that participates in dosage compensation (DC). Condensin DC is recruited to and spreads from a small number of r ecruit e lements on the X -chromosome ( rex ) and is required for the formation of topologically associating domains (TADs). We take advantage of autosomes that are largely devoid of condensin DC and TADs to address how rex sites and condensin DC give rise to the formation of TADs. When an autosome and X-chromosome are physically fused, despite the spreading of condensin DC into the autosome, no TAD was created. Insertion of a strong rex on the X-chromosome results in the TAD boundary formation regardless of sequence orientation. When the same rex is inserted on an autosome, despite condensin DC recruitment, there was no spreading or features of a TAD. On the other hand, when a “super rex” composed of six rex sites or three separate rex sites are inserted on an autosome, recruitment and spreading of condensin DC led to formation of TADs. Therefore, recruitment to and spreading from rex sites are necessary and sufficient for recapitulating loop-anchored TADs observed on the X-chromosome. Together our data suggest a model in which rex sites are both loading sites and bidirectional barriers for condensin DC, a one-sided loop-extruder with movable inactive anchor.

Summary Condensin complexes are evolutionarily conserved molecular motors that translocate along DNA and form loops. While condensin-mediated DNA looping is thought to direct the chain-passing activity of topoisomerase II to separate sister chromatids, it is not known if topological constraints in turn regulate loop formation in vivo . Here we applied auxin inducible degradation of topoisomerases I and II to determine how DNA topology affects the translocation of an X chromosome specific condensin that represses transcription for dosage compensation in C. elegans (condensin DC). We found that both topoisomerases colocalize with condensin DC and control its movement at different genomic scales. TOP-2 depletion hindered condensin DC translocation over long distances, resulting in accumulation around its X-specific recruitment sites and shorter Hi-C interactions. In contrast, TOP-1 depletion did not affect long-range spreading but resulted in accumulation of condensin DC within expressed gene bodies. Both TOP-1 and TOP-2 depletions resulted in X chromosome transcriptional upregulation indicating that condensin DC translocation at both scales is required for its function in gene repression. Together the distinct effects of TOP-1 and TOP-2 on condensin DC distribution revealed two distinct modes of condensin DC association with chromatin: long-range translocation that requires decatenation/unknotting of DNA and short-range translocation across genes that requires resolution of transcription-induced supercoiling.

ABSTRACT The auxin-inducible degradation system in C. elegans allows for spatial and temporal control of protein degradation via heterologous expression of a single Arabidopsis thaliana F-box protein, transport inhibitor response 1 ( At TIR1). In this system, exogenous auxin (Indole-3-acetic acid; IAA) enhances the ability of At TIR1 to function as a substrate recognition component that adapts engineered degron-tagged proteins to the endogenous C. elegans E3 ubiquitin ligases complex (SKR-1/2-CUL-1-F-box (SCF)), targeting them for degradation by the proteosome. While this system has been employed to dissect the developmental functions of many C. elegans proteins, we have found that several auxin-inducible degron (AID)-tagged proteins are constitutively degraded by At TIR1 in the absence of auxin, leading to undesired loss-of-function phenotypes. In this manuscript, we adapt an orthogonal auxin-derivative/mutant At TIR1 pair ( C. elegans AID version 2 ( C.e. AIDv2)) that transforms the specificity of allosteric regulation of TIR1 from IAA to one that is dependent on an auxin derivative harboring a bulky aryl group (5-Ph-IAA). We find that a mutant At TIR1(F79G) allele that alters the ligand binding interface of TIR1 dramatically reduces ligand-independent degradation of multiple AID*-tagged proteins. In addition to solving the ectopic degradation problem for some AID targets, addition of 5-Ph-IAA to culture media of animals expressing At TIR1(F79G) leads to more penetrant loss-of-function phenotypes for AID*-tagged proteins than those elicited by the At TIR1-IAA pairing at similar auxin analog concentrations. The improved specificity and efficacy afforded by the mutant At TIR1(F79G) allele expands the utility of the AID system and broadens the number of proteins that can be effectively targeted with it. ARITCLE SUMMARY Implementation of the auxin induced degradation (AID) system has increased the power if the C. elegans model through its ability to rapidly degrade target proteins in the presence of the plant hormone auxin (IAA). The current C.e .AID system is limited in that a substantial level of target degradation occurs in the absence of ligand and full levels of target protein degradation require high levels of auxin inducer. In this manuscript, we modify the AID system to solve these problems.

ABSTRACT Condensins are evolutionarily conserved protein complexes that are required for chromosome segregation during cell division and genome organization during interphase. In C. elegans ,, a specialized condensin, which forms the core of the dosage compensation complex (DCC), binds to and represses X chromosome transcription. Here, we analyzed DCC localization and the effect of DCC depletion on histone modifications, transcription factor binding, and gene expression using ChIP-seq and mRNA-seq. Across the X, DCC accumulates at accessible gene regulatory sites in active chromatin and not heterochromatin. DCC is required for reducing the levels of activating histone modifications, including H3K4me3 and H3K27ac, but not repressive modification H3K9me3. In X-to-autosome fusion chromosomes, DCC spreading into the autosomal sequences locally reduces gene expression, thus establishing a direct link between DCC binding and repression. Together, our results indicate that DCC-mediated transcription repression is associated with a reduction in the activity of X chromosomal gene regulatory elements. SUMMARY Condensins are evolutionarily conserved protein complexes that mediate chromosome condensation during cell division and have been implicated in gene regulation during interphase. Here, we analyzed the gene regulatory role of an X-specific condensin (DCC) in C. elegans , by measuring its effect on histone modifications associated with transcription regulation. We found that in X-to-autosome fusion chromosomes, DCC spreading into autosomal sequences locally reduces gene expression, establishing a direct link between DCC binding and repression. DCC is required for reduced levels of histone modifications associated with transcription activation at X chromosomal promoters and enhancers. These results are consistent with a model whereby DCC binding directly or indirectly results in a reduction in the activity of X chromosomal gene regulatory elements through specific activating histone modifications.

ABSTRACT Isolation of copy number variations and chromosomal duplications at high frequency in the laboratory suggested that Caenorhabditis elegans tolerates increased gene dosage. Here we addressed if a general dosage compensation mechanism acts at the level of mRNA expression in C. elegans . We characterized gene dosage and mRNA expression in three chromosomal duplications and a fosmid integration strain using DNA-seq and mRNA-seq. Our results show that on average, increased gene dosage leads to increased mRNA expression, pointing to a lack of genome-wide dosage compensation. Different genes within the same chromosomal duplication show variable levels of mRNA increase, suggesting feedback regulation of individual genes. Somatic dosage compensation and germline repression reduce the level of mRNA increase from X chromosomal duplications. Together, our results show a lack of genome-wide dosage compensation mechanism acting at the mRNA level in C. elegans and highlight the role of epigenetic and individual gene regulation contributing to the varied consequences of increased gene dosage.

ABSTRACT Condensin is a multi-subunit SMC complex that binds to and compacts chromosomes. Here we addressed the regulation of condensin binding dynamics using C. elegans condensin DC, which represses X chromosomes in hermaphrodites for d osage c ompensation. We established fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) using the SMC4 homolog DPY-27 and showed that a well-characterized ATPase mutation abolishes its binding. Next, we performed FRAP in the background of several chromatin modifier mutants that cause varying degrees of X-chromosome derepression. The greatest effect was in a null mutant of the H4K20me2 demethylase DPY-21, where the mobile fraction of condensin DC reduced from ∼30% to 10%. In contrast, a catalytic mutant of dpy-21 did not regulate condensin DC mobility. Hi-C data in the dpy-21 null mutant showed little change compared to wild type, uncoupling Hi-C measured long-range DNA contacts from transcriptional repression of the X chromosomes. Together, our results indicate that DPY-21 has a non-catalytic role in regulating the dynamics of condensin DC binding, which is important for transcription repression.