Summary The deep subsurface contains a vast reservoir of microbial life. While recent studies have revealed critical details about this biosphere including the sheer diversity of microbial taxa and their metabolic potential, long-term monitoring of deep subsurface microbial populations is rare, thus limiting our understanding of subsurface microbial population dynamics. Here we present a four-year time series analysis of subsurface microbial life from the Deep Mine Microbial Observatory (DeMMO), Lead, SD, USA. We find distinct and diverse populations inhabiting each of 6 sites over this ~1.5 km deep slice of terrestrial crust, corresponding to distinct geochemical habitats. Alpha diversity decreases with depth and beta diversity measures clearly differentiate samples by site over time, even during substantial perturbations. Population dynamics are driven by a subset of variable (and often relatively abundant) OTUs, but the vast majority of detected OTUs are stable through time, constituting a core microbial community. The phylogenetic affiliations of both stable and variable taxa, including putative sulfate reducers, methanogens, spore formers, and many uncultivated lineages, are similar to those found previously in subsurface environments. This work reveals the dynamic nature of the terrestrial subsurface, contributing to a more holistic understanding than can be achieved when viewing shorter timeframes. Originality-Significance Statement This four-year record of deep mine microbial diversity and geochemistry is the first of its kind and allows for direct investigation of temporal trends in deep subsurface biogeochemistry. We identify disparate populations of variable and stable taxa, suggesting the presence of a core deep subsurface microbiome with unique niche partitioning.

ABSTRACT The deep terrestrial subsurface is a large and diverse microbial habitat and a vast repository of biomass. However, in relation to its size and physical heterogeneity we have limited understanding of taxonomic and metabolic diversity in this realm. Here we present a detailed metagenomic analysis of samples from the Deep Mine Microbial Observatory (DeMMO) spanning depths from the surface to 1.5 km deep in the crust. From these eight geochemically and spatially distinct fluid samples we reconstructed ∼600 metagenome assembled genomes (MAGs), representing 50 distinct phyla and including 18 candidate phyla. These novel clades include many members of the Patescibacteria superphylum and two new MAGs from candidate phylum OLB16, a phylum originally identified in DeMMO fluids and for which only one other MAG is currently available. We find that microbes spanning this expansive phylogenetic diversity and physical space are often capable of numerous dissimilatory energy metabolisms and are poised to take advantage of nutrients as they become available in relatively isolated fracture fluids. This metagenomic dataset is contextualized within a four-year geochemical and 16S rRNA time series, adding another invaluable piece to our knowledge of deep subsurface microbial ecology.

Continental subsurface environments can present significant energetic challenges to the resident microorganisms. While these environments are geologically diverse, potentially allowing energy harvesting by microorganisms that catalyze redox reactions, many of the abundant electron donors and acceptors are insoluble and therefore not directly bioavailable. Extracellular electron transfer (EET) is a metabolic strategy that microorganisms can deploy to meet the challenges of interacting with redox-active surfaces. Though mechanistically characterized in a few metal-reducing bacteria, the role, extent, and diversity of EET in subsurface ecosystems remains unclear. Since this process can be mimicked on electrode surfaces, it opens the door to electrochemical techniques to enrich for and quantify the activities of environmental microorganisms in situ. Here, we report the electrochemical enrichment of microorganisms from a deep fractured-rock aquifer in Death Valley, California, USA. In experiments performed in mesocosms containing a synthetic medium based on aquifer chemistry, four working electrodes were poised at different redox potentials (272, 373, 472, 572 mV vs. SHE) to serve as electron acceptors, resulting in anodic currents coupled to the oxidation of acetate during enrichment. The anodes were dominated by Betaproteobacteria from the families Comamonadaceae and Rhodocyclaceae. A representative of each dominant family was subsequently isolated from electrode-associated biomass. The EET abilities of the isolated Delftia strain (designated WE1-13) and Azonexus strain (designated WE2-4) were confirmed in electrochemical reactors using working electrodes poised at 522 mV vs. SHE. The rise in anodic current upon inoculation was correlated with a modest increase in total protein content. Both genera have been previously observed in mixed communities of microbial fuel cell enrichments, but this is the first direct measurement of their electrochemical activity. While alternate metabolisms (e.g. nitrate reduction) by these organisms were previously known, our observations suggest that additional 'hidden' interactions with external electron acceptors are also possible. Electrochemical approaches are well positioned to dissect such extracellular interactions that may be prevalent in the subsurface.

While recent efforts to catalogue global microbial diversity have focused upon surface and marine habitats, 12% to 20% of terrestrial bacterial and archaeal biomass is suggested to inhabit the terrestrial deep subsurface, compared to ~1.8% in the deep subseafloor. Metagenomic studies of the terrestrial deep subsurface have yielded a trove of divergent and functionally important microbiomes from a range of localities. However, a wider perspective of microbial diversity and its relationship to environmental conditions within the terrestrial deep subsurface is still required. Here, we show the diversity of bacterial communities in deep subsurface groundwater is controlled by aquifer lithology globally, by using 16S rRNA gene datasets collected across five countries on two continents and from fifteen rock types over the past decade. Furthermore, our meta-analysis reveals that terrestrial deep subsurface microbiota are dominated by Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria and Firmicutes, likely as a function of the diverse metabolic strategies of these taxa. Despite this similarity, evidence was found not only for aquifer-specific microbial communities, but also for a common small consortium of prevalent Betaproteobacteria and Gammaproteobacterial OTUs across the localities. This finding implies a core terrestrial deep subsurface community, irrespective of aquifer lithology, that may play an important role in colonising and sustaining microbial habitats in the deep terrestrial subsurface. An in-silico contamination-aware approach to analysing this dataset underscores the importance of downstream methods for assuring that robust conclusions can be reached from deep subsurface-derived sequencing data. Understanding the global panorama of microbial diversity and ecological dynamics in the deep terrestrial subsurface provides a first step towards understanding the role of microbes in global subsurface element and nutrient cycling.

ABSTRACT Microbes can be found in abundance many kilometers underground. While microbial metabolic capabilities have been examined across different geochemical settings, it remains unclear how changes in subsurface niches affect microbial needs to sense and respond to their environment. To address this question, we examined how two component systems (TCS) vary across metagenomes in the Deep Mine Microbial Observatory (DeMMO). TCSs were found at all six subsurface sites, the service water control, and the surface site, with an average of 0.88 sensor histidine kinases (HKs) per 100 genes across all sites. Abundance was greater in subsurface fracture fluids compared with surface-derived fluids, and candidate phyla radiation (CPR) bacteria presented the lowest HK frequencies. Measures of microbial diversity, such as the Shannon diversity index, revealed that HK abundance is inversely correlated with microbial diversity (r 2 = 0.81). Among the geochemical parameters measured, HK frequency correlated the strongest with variance in dissolved organic carbon (DOC) (r 2 = 0.82). Taken together, these results implicate the abiotic and biotic properties of an ecological niche as drivers of sensor needs, and they suggest that microbes in environments with large fluctuations in organic nutrients ( e . g ., lacustrine, terrestrial, and coastal ecosystems) may require greater TCS diversity than ecosystems with low nutrients ( e . g ., open ocean). IMPORTANCE The ability to detect environmental conditions is a fundamental property of all life forms. However, organisms do not maintain the same environmental sensing abilities during evolution. To better understand the controls on microbial sensor abundance, which remain poorly understood, we evaluated how two-component sensor systems evolved within the deep Earth across sampling sites where abiotic and biotic properties vary. We quantify the relative abundances of sensor proteins and find that sensor systems remain abundant in microbial consortia as depth below the Earth’s surface increases. We also observe correlations between sensor system abundances and abiotic (dissolved organic carbon variation) and biotic (consortia diversity) properties across the DeMMO sites. These results suggest that multiple environmental properties drive sensor protein evolution and diversification and highlight the importance of studying metagenomic and geochemical data in parallel to understand the drivers of microbial sensor evolution.