Abstract Purpose: Patients with anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene rearrangements often manifest dramatic responses to crizotinib, a small-molecule ALK inhibitor. Unfortunately, not every patient responds and acquired drug resistance inevitably develops in those who do respond. This study aimed to define molecular mechanisms of resistance to crizotinib in patients with ALK+ non–small cell lung cancer (NSCLC). Experimental Design: We analyzed tissue obtained from 14 patients with ALK+ NSCLC showing evidence of radiologic progression while on crizotinib to define mechanisms of intrinsic and acquired resistance to crizotinib. Results: Eleven patients had material evaluable for molecular analysis. Four patients (36%) developed secondary mutations in the tyrosine kinase domain of ALK. A novel mutation in the ALK domain, encoding a G1269A amino acid substitution that confers resistance to crizotinib in vitro, was identified in two of these cases. Two patients, one with a resistance mutation, exhibited new onset ALK copy number gain (CNG). One patient showed outgrowth of epidermal growth factor receptor (EGFR) mutant NSCLC without evidence of a persistent ALK gene rearrangement. Two patients exhibited a KRAS mutation, one of which occurred without evidence of a persisting ALK gene rearrangement. One patient showed the emergence of an ALK gene fusion–negative tumor compared with the baseline sample but with no identifiable alternate driver. Two patients retained ALK positivity with no identifiable resistance mechanism. Conclusions: Crizotinib resistance in ALK+ NSCLC occurs through somatic kinase domain mutations, ALK gene fusion CNG, and emergence of separate oncogenic drivers. Clin Cancer Res; 18(5); 1472–82. ©2012 AACR.

In our previous study we showed that insulin-like growth factor-I induces a cAMP-response element (CRE) site-containing Bcl-2 promoter through a novel signaling pathway involving mitogen-activated protein kinase kinase 6/p38β mitogen-activated protein kinase/MAP kinase-activated protein kinase-3/cAMP-response element-binding protein (CREB) (Pugazhenthi, S., Miller, E., Sable, C., Young, P., Heidenreich, K. A., Boxer, L. M., and Reusch, J. E.-B. (1999)J. Biol. Chem. 274, 27529–27535). In the present investigation, we define a second pathway contributing to CREB-dependent up-regulation of Bcl-2 expression as a novel anti-apoptotic function of Akt signaling. To examine the role of Akt on Bcl-2 expression, a series of transient transfections using a luciferase reporter gene driven by the promoter region of Bcl-2 containing a CRE were carried out. Pharmacological inhibition of phosphatidylinositol (PI) 3-kinase, the upstream kinase of Akt, with LY294002 led to a 45% decrease in Bcl-2 promoter activity. The reporter activity was enhanced 2.3-fold by overexpression of active p110 subunit of PI 3-kinase and inhibited 44% by the dominant negative p85 subunit of PI 3-kinase. Cotransfection with 3-phosphoinositide-dependent kinase (PDK1), which is required for the full activation of Akt, resulted in enhanced luciferase activity. Insulin-like growth factor-I-mediated induction of Bcl-2 promoter activity was decreased significantly (p < 0.01) by the dominant negative forms of p85 subunit of PI 3-kinase, PDK1, and Akt. These data indicate that regulation of Bcl-2 expression by IGF-I involves a signaling cascade mediated by PI 3-kinase/PDK1/Akt/CREB. Furthermore, we measured the Bcl-2 mRNA in PC12 cells overexpressing Akt by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction using the TaqManTMfluorogenic probe system. We observed a 2.1-fold increase in Bcl-2 mRNA levels in the Akt cell line compared with control PC12 cells, supporting the observation that enhanced CREB activity by Akt signaling leads to increased Bcl-2 promoter activity and cell survival. In our previous study we showed that insulin-like growth factor-I induces a cAMP-response element (CRE) site-containing Bcl-2 promoter through a novel signaling pathway involving mitogen-activated protein kinase kinase 6/p38β mitogen-activated protein kinase/MAP kinase-activated protein kinase-3/cAMP-response element-binding protein (CREB) (Pugazhenthi, S., Miller, E., Sable, C., Young, P., Heidenreich, K. A., Boxer, L. M., and Reusch, J. E.-B. (1999)J. Biol. Chem. 274, 27529–27535). In the present investigation, we define a second pathway contributing to CREB-dependent up-regulation of Bcl-2 expression as a novel anti-apoptotic function of Akt signaling. To examine the role of Akt on Bcl-2 expression, a series of transient transfections using a luciferase reporter gene driven by the promoter region of Bcl-2 containing a CRE were carried out. Pharmacological inhibition of phosphatidylinositol (PI) 3-kinase, the upstream kinase of Akt, with LY294002 led to a 45% decrease in Bcl-2 promoter activity. The reporter activity was enhanced 2.3-fold by overexpression of active p110 subunit of PI 3-kinase and inhibited 44% by the dominant negative p85 subunit of PI 3-kinase. Cotransfection with 3-phosphoinositide-dependent kinase (PDK1), which is required for the full activation of Akt, resulted in enhanced luciferase activity. Insulin-like growth factor-I-mediated induction of Bcl-2 promoter activity was decreased significantly (p < 0.01) by the dominant negative forms of p85 subunit of PI 3-kinase, PDK1, and Akt. These data indicate that regulation of Bcl-2 expression by IGF-I involves a signaling cascade mediated by PI 3-kinase/PDK1/Akt/CREB. Furthermore, we measured the Bcl-2 mRNA in PC12 cells overexpressing Akt by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction using the TaqManTMfluorogenic probe system. We observed a 2.1-fold increase in Bcl-2 mRNA levels in the Akt cell line compared with control PC12 cells, supporting the observation that enhanced CREB activity by Akt signaling leads to increased Bcl-2 promoter activity and cell survival. 3-phosphoinositide-dependent kinase 1 insulin-like growth factor cAMP response element CRE-binding protein mitogen-activated protein (MAP) kinase phosphate-buffered saline phosphatidylinositol 3-kinase reverse transcription-polymerase chain reaction The serine threonine kinase Akt/protein kinase B is an important mediator of metabolic as well as survival responses to insulin and growth factors (1.Coffer P.J. Jin J. Woodgett J.R. Biochem. J. 1998; 335: 1-13Crossref PubMed Scopus (973) Google Scholar). Akt is activated by translocation to plasma membrane when the PI 3-kinase-generated 3-phosphoinositides bind to its pleckstrin homology domain (2.Downward J. Curr. Opin. Cell Biol. 1998; 10: 262-267Crossref PubMed Scopus (1194) Google Scholar). For its full activation it needs to be further phosphorylated by 3-phosphoinositide-dependent kinase1 (PDK1)1 at Thr-308 and by PDK2 at Ser-473. The metabolic actions of insulin mediated by Akt include stimulation of GLUT4 translocation and activation of glycogen synthase and the glycolytic enzyme 6-phosphofructose-2-kinase (1.Coffer P.J. Jin J. Woodgett J.R. Biochem. J. 1998; 335: 1-13Crossref PubMed Scopus (973) Google Scholar). In addition to its metabolic actions, Akt/protein kinase B has been shown to promote cell survival by growth factors against several apoptotic stimuli (3.Dudek H. Datta S.R. Franke T.F. Birnbaum M.J. Yao R. Cooper G.M. Segal R.A. Kaplan D.R. Greenberg M.E. Science. 1997; 275: 661-664Crossref PubMed Scopus (2245) Google Scholar, 4.Kulik G. Klippel A. Weber M.J. Mol. Cell. Biol. 1997; 17: 1595-1606Crossref PubMed Scopus (968) Google Scholar). The Bcl-2 family of proteins consisting of pro-apoptotic Bad, Bik, Bid. Etc. and anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-xL are important regulators of mammalian apoptosis (5.Merry D.E. Korsmeyer S.J. Annu. Rev. Neurosci. 1997; 20: 245-267Crossref PubMed Scopus (551) Google Scholar). Bcl-2/Bcl-xL prevents the activation of caspase-9 by Apaf-1 and cytochrome c (6.Adams J.M. Cory S. Science. 1998; 281: 1322-1326Crossref PubMed Scopus (4855) Google Scholar). Bcl-2 and Bad heterodimerize and neutralize each other's function. The fate of cells exposed to apoptotic signal is determined by the balance between pro- and anti-apoptotic proteins. One mechanism by which Akt prevents apoptosis is considered to proceed through phosphorylation of the pro-apoptotic protein Bad on Ser-136 (7.Datta S.R. Dudek H. Tao X. Masters S. Fu H. Gotoh Y. Greenberg M.E. Cell. 1997; 91: 231-241Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (5003) Google Scholar). Phosphorylated Bad is sequestered by 14-3-3 protein, leading to its down-regulation. It has been also suggested that additional mechanisms might exist for the cell survival-promoting action of Akt (8.Hinton H.J. Welham M.J. J. Immunol. 1999; 162: 7002-7009PubMed Google Scholar, 9.Scheid M.P. Duronio V. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 7439-7444Crossref PubMed Scopus (276) Google Scholar). Up-regulation of Bcl-2 expression has been identified as a critical mechanism by which growth factors promote cell survival (10.Singleton J.R. Dixit V.M. Feldman E.L. J. Biol. Chem. 1996; 271: 31791-31794Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (156) Google Scholar, 11.Tamatani M. Ogawa S. Tohyama M. Mol. Brain Res. 1998; 58: 27-39Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar, 12.Minshall C. Arkins S. Straza J. Conners J. Dantzer R. Freund G.G. Kelley K.W. J. Immunol. 1997; 159: 1225-1232PubMed Google Scholar, 13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar). The promoter region of Bcl-2 contains a cAMP-response element (CRE) site, and the transcription factor CREB has been identified as a positive regulator of Bcl-2 expression (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar, 14.Wilson B.E. Mochon E. Boxer L.M. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 5546-5556Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar). Akt, a target of IGF-I signaling, has been shown to activate CREB (15.Du K. Montminy M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 32377-32379Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (835) Google Scholar). Thus, it seemed possible that Akt activation through PI 3-kinase could mediate regulation of Bcl-2 expression by IGF-I. In our previous studies in PC12 cells, we identified that three post-receptor pathways activated by IGF-I through extracellular-regulated kinase, p38β MAPK, and PI 3-kinase are capable of mediating Ser-133 phosphorylation of CREB (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar, 16.Pugazhenthi S. Boras T. O'Connor D. Meintzer M.K. Heidenreich K.A. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2829-2837Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (109) Google Scholar). However, in the context of CREB-driven Bcl-2 promoter, activation of the extracellular-regulated kinase pathway has been shown to have a negative regulatory effect through Ets domain transcription factors (14.Wilson B.E. Mochon E. Boxer L.M. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 5546-5556Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar). We identified a novel IGF-I-mediated signaling cascade involving MAP kinase kinase 6/p38β MAPK/MAP kinase-activated protein kinase-3/CREB, leading to the induction of Bcl-2 promoter (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar). However, SB203580, the p38 MAPK inhibitor blocked IGF-I-induced Bcl-2 promoter activity only partially. Earlier work in our laboratory demonstrated that IGF-I-mediated CREB phosphorylation and activation of CRE site-containing chromogranin A promoter requires PI 3-kinase (16.Pugazhenthi S. Boras T. O'Connor D. Meintzer M.K. Heidenreich K.A. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2829-2837Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (109) Google Scholar). In that study, a dominant negative form of the regulatory subunit of PI 3-kinase was able to block IGF-I-mediated induction of a CRE site-containing promoter of chromogranin A, a neuro endocrine-specific gene. Du and Montminy (15.Du K. Montminy M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 32377-32379Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (835) Google Scholar) demonstrated recently that Akt stimulates the phosphorylation and the transcriptional activity of the CREB in HEK 293 cells. These reports clearly raise the possibility that Akt could mediate part of the IGF-I-induced increase in the expression of Bcl-2 at the transcriptional level. The objective of the present study was to examine whether IGF-I mediated signaling through PI 3-kinase and Akt leads to a CREB-dependent increase in Bcl-2 promoter activity. The pharmacological inhibitors LY294002 and rapamycin were from Biomol (Plymouth Meeting, PA). Cell culture media and supplies were purchased from Gemini Bio Products, Inc (Calabasas, CA) and Life Technologies, Inc. The CRE site-containing promoter region of bcl-2 gene was linked to a luciferase reporter as described previously (14.Wilson B.E. Mochon E. Boxer L.M. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 5546-5556Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar). A luciferase reporter gene driven by TATA box joined to tandem repeats of CRE (4×) was purchased from Stratagene (La Jolla, CA). Plasmids for transfection experiments were purified using Qiagen's (Valencia, CA) maxi kit. Antibodies specific for Phospho (Ser-133) CREB and CREB were from New England Biolabs (Beverly, MA). The luciferase assay kit was purchased from Pharmingen (San Diego, CA). Rat pheochromocytoma (PC12) cells (provided by Dr. Derek LeRoith (NIDDK, National Institutes of Health, Bethesda, MD) were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum, 5% heat-inactivated horse serum, 100 μg/ml streptomycin, and 100 microunits/ml penicillin at 37 °C in a humidified atmosphere at 8% CO2. A cDNA encoding Akt with the Src myristoylation sequence at the N terminus (17.Ahmed N.N. Grimes H.L. Bellacosa A. Chan T.O. Tsichlis P.N. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 3627-3632Crossref PubMed Scopus (490) Google Scholar) in the retroviral vector pLNCX (18.Miller A.D. Rosman G.J. Biotechniques. 1989; 7: 980-990PubMed Google Scholar) was packaged into replication-defective retrovirus using 293T cells along with the plasmids SV-ψ-A-MLV and SV-ψ-env−-MLV by the procedure described previously (19.Landau N.R. Littman D.R. J. Virol. 1992; 66: 5110-5113Crossref PubMed Google Scholar,20.Pear W.S. Nolan G.P. Scott M.L. Baltimore D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 8392-8396Crossref PubMed Scopus (2331) Google Scholar). Secreted retrovirus was supplemented with polybrene (8 μg/ml), filtered (0.45 μm), and incubated with PC12 cells for 24 h. Cells expressing Akt were selected by culturing them in medium containing G418. Apoptosis was induced in control PC12 (Neo-21) and the Akt clone by exposing them to serum-free medium for 72 h, and the viable cells were counted. Alternatively, the cells in regular medium were UV-irradiated (32 J/M2), and 24 h later, the viable cells were counted. Cells were cultured in 6 × 35-mm wells coated with poly-l-lysine for transfection studies. Control and Akt-overexpressing PC12 cells were cultured in regular medium. Total RNA was isolated from these cells using TRIzol reagent (Life Technologies, Inc.) as per the manufacturer's protocol. RNA samples were further purified by DNase digestion and extraction with phenol and chloroform. The mRNA for Bcl-2 was measured by real-time quantitative RT-PCR using PE Applied Biosystems prism model 7700 sequence detection instrument. The sequences of forward and reverse primers as designed by Primer Express (PE ABI) were 5′-TGGGATGCCTTTGTGGAACT-3′ and 5′-GAGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3′, respectively. The TaqManTM fluorogenic probe used was 5′-6FAM-TGGCCCCAGCATGCGACCTC-TAMRA-3′. During PCR amplification, 5′ nucleolytic activity of Taq polymerase cleaves the probe separating the 5′ reporter fluorescent dye from the 3′ quencher dye (21.Heid C.A. Stevens J. Livak K.J. Williams P.M. Genome Res. 1996; 6: 986-994Crossref PubMed Scopus (5089) Google Scholar, 22.Gibson U.E.M. Heid C.A. Williams P.M. Genome Res. 1996; 6: 995-1001Crossref PubMed Scopus (1795) Google Scholar). Threshold cycle, Ct, which correlates inversely with the target mRNA levels, was measured as the cycle number at which the reporter fluorescent emission increases above a threshold level. The Bcl-2 mRNA levels were corrected for 18 S ribosomal RNA, which was measured using a kit (PEABI, P/N 4308310) from Perkin-Elmer as per the manufacturer's protocol. PC12 cells cultured in poly-l-lysine-coated 60-mm dishes under appropriate conditions were washed twice with ice-cold PBS, and the cell lysates were prepared. Protein content of lysates was measured (23.Bradford M.M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254Crossref PubMed Scopus (225068) Google Scholar), and appropriately diluted samples (containing equal amounts of protein) were mixed with 2× Laemmli sample buffer containing 100 mmdithiothreitol. The proteins resolved on a 12% SDS-polyacrylamide gels were transferred to polyvinylidene difluoride membranes. After blocking with Tris-buffered saline with Tween (20 mm Tris-HCl (pH 7.9), 8.5% NaCl, and 0.1% Tween 20) containing 5% non-fat dry milk at room temperature for 1 h, the blots were treated with the primary antibody in blocking buffer at 4 °C overnight. The blots were washed with blocking buffer and incubated with anti-rabbit IgG conjugated to alkaline phosphatase for 1 h at room temperature. After further washes with blocking buffer and with 10 mmTris-HCl (pH 9.5), 10 mm NaCl, 1 mmMgCl2, the blots were developed with CDP-Star reagent (New England Biolabs) and exposed to x-ray film. Transient transfections were carried out by the procedure described earlier using LipofectAMINE Plus reagent (Life Technologies, Inc.) (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar). The cells were cultured to around 70% confluence in 6 × 35-mm plates. One μg of plasmid, 3 μl of Plus reagent, and 10 μg of LipofectAMINE reagent were used for each well. To normalize the transfection efficiency, the plasmid containing β-galactosidase gene driven by SV40 promoter was included. DNA and the LipofectAMINE reagent diluted in 100 μl of serum and antibiotic-free medium were mixed together and incubated at room temperature for 30 min. After washing the cells with PBS, 800 μl of serum and antibiotic-free medium was added. The plasmid and LipofectAMINE mixture was added to each well and incubated for 5 h. Then the cells were cultured in regular medium for 24 h before appropriate treatment. The cells were washed with cold PBS and lysed with 100 μl of reporter lysis buffer. After freezing and thawing, the lysate was centrifuged at 14,000 rpm for 30 min to collect the supernatant. Luciferase was assayed using the enhanced luciferase assay kit (Pharmingen) on a Monolight 2010 luminometer. The β-galactosidase assay was carried out as described earlier (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar). Statistical analysis was performed by Student's t test. To investigate the role of PI 3-kinase in the regulation of Bcl-2 expression, PC12 cells transfected with a Bcl-2 promoter construct containing a CRE site were treated with the PI 3-kinase inhibitor LY294002. There was a 45% decrease (p < 0.01) in the reporter activity in the presence of the inhibitor (Fig. 1 A), suggesting a positive role for PI 3-kinase. To confirm these observations, a series of transient transfections with constitutively active p110 subunit and the dominant negative p85 subunit of PI 3-kinase were carried out. Fig. 1 B demonstrates the ability of PI 3 kinase activation to augment basal and IGF-I-stimulated Bcl-2 promoter activity. The basal activity increased by 2.3-fold in the presence of p110, whereas it was decreased to 56% of control by Δ p85. IGF-I-mediated regulation of Bcl-2 promoter activity was similarly affected. These observations indicate that IGF-I-induced Bcl-2 expression proceeds in part through activation of PI 3-kinase. Rapamycin did not inhibit the Bcl-2 promoter activity (Fig.1 A), suggesting a role for Akt rather than p70 s6 kinase in mediating PI 3-kinase action. Full activation of Akt is known to require phosphorylation on Thr-308 by PDK-1, a kinase downstream of PI 3-kinase (1.Coffer P.J. Jin J. Woodgett J.R. Biochem. J. 1998; 335: 1-13Crossref PubMed Scopus (973) Google Scholar). We therefore examined the impact of PDK1 and dominant negative PDK1 on Bcl-2 promoter activity. Cotransfection of PC12 cells with PDK1 resulted in a 2.0-fold increase in reporter activity (Fig. 1 C). The increase in reporter activity by PDK1 was further enhanced 66% by IGF-I, probably due to its induction through p38β MAPK mediated pathway (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar). In contrast, kinase dead PDK1 decreased basal and IGF-I-mediated reporter activity by 37 and 62%, respectively. These data demonstrate important roles for PI 3-kinase and PDK1 in the transcriptional regulation of Bcl-2 expression. Akt is one of the downstream targets of PI 3-kinase signaling. Du and Montminy (15.Du K. Montminy M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 32377-32379Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (835) Google Scholar) recently reported the positive regulation of CREB activity by Akt. To explore whether Akt regulation of Bcl-2 required CREB, we examined the impact of dominant negative form of CREB, KCREB, on the Akt-stimulated Bcl-2 promoter activity. As shown in Fig. 2 A, Akt-stimulated Bcl-2 reporter activity is decreased by KCREB. However, KCREB did not completely block Akt-mediated activation of the reporter. This could be due to the CREB-independent component in the activation of Bcl-2 promoter (14.Wilson B.E. Mochon E. Boxer L.M. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 5546-5556Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar). In our previous study, we observed that the promoter retained modest activity after deletion or mutation of the CRE site (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar). Furthermore cotransfection of the reporter with the dominant negative Akt (T308A; S473A) decreased basal and IGF-I-stimulated luciferase activity by 40% (p < 0.01) (Fig.2 B). These data support a role for the PI 3-kinase/PDK1/Akt/CREB pathway as a second signaling pathway important for IGF-I regulation of bcl-2 gene expression. However PDK1 is known to have potential targets such as p90rsk and protein kinase C isoforms in addition to Akt that are capable of activating CREB. Hence we examined the effect of dominant negative Akt on PDK1-mediated induction. We did observe that PDK1 mediated stimulation of Bcl-2 promoter activity in the absence and presence of IGF-I to be decreased by 51 and 48%, respectively, when the dominant negative Akt was included in the cotransfection experiments. The possibility of PDK1 modestly activating Bcl-2 promoter through other pathways involving p90rsk and protein kinase C isoforms cannot be ruled out. Further studies are needed to explore these pathways in detail. The results of previous experiments clearly demonstrated that Akt-mediated signaling activates Bcl-2 promoter through CREB, and this transcription factor needs to be phosphorylated for its activation. We therefore examined whether CREB phosphorylation on Ser-133 activation site is increased in PC12 cells expressing myristoylated Akt. We noted a significant (90%; p < 0.01) increase in CREB phosphorylation in these cells in the absence of IGF-I (Fig. 3, A andB). When these cells were treated with IGF-I (100 ng/ml) for 10 min, CREB phosphorylation increased from 2.2-fold in control cells to 2.9-fold in Akt-expressing cells. This enhanced PCREB formation could be due to growth factor action through p38β MAPK-mediated pathway as shown in our previous study (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar). The CREB protein levels did not change significantly under different experimental conditions (Fig. 3 B). Hence Akt seems to activate CREB at the post-translational level. We next examined the CREB activity in the cells expressing Akt using a luciferase reporter driven by a CRE site-containing Bcl-2 promoter. The promoter activity was elevated in Akt cells both in the absence and presence of IGF-I (Fig.3 C), correlating with the increased CREB phosphorylation observed in the previous experiment (Fig. 3 A). Interestingly, culturing transfected control cells in low serum medium resulted in a 40% decrease in promoter activity, whereas cells expressing Akt maintained its activation in the presence of low serum (Fig. 3 C). Similar results were obtained with a luciferase reporter driven by four tandem repeats of CRE sites (results not shown). Furthermore, PC12 cells expressing Akt were found to have increased survival after serum withdrawal and exposure to UV (TableI). After 72 h of culture in serum-free medium, the survival rate was as high as 86% in the Akt clone as compared with 26% control cells. In addition, Akt increased survival in UV-exposed PC12 cells to 76% from 38% seen in control cells.Table ISerum withdrawal-mediated and UV-induced apoptosis in PC12 cells expressing AktCell survivalSerum-freeUV% of controlNeo-2126.0 ± 9.937.9 ± 11.4Akt86.2 ± 14.5a< 0.01 vs. Neo-21.75.6 ± 14.2a< 0.01 vs. Neo-21.PC12 cells expressing the vector LNCX (Neo-21) or LNCX-Myr-Akt were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium without serum for 72 h, after which the viable cells were counted. The cell survival rate was expressed as percentage of viable cells that has been cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 1% horse serum. Furthermore, the above mentioned clones were UV-irradiated (32 J/m2), and after 24 h, the viable cells were counted. The data are presented as percentage of viable cells in a control culture without radiation. The results are the mean ± S.E. of three independent experiments.a < 0.01 vs. Neo-21. Open table in a new tab PC12 cells expressing the vector LNCX (Neo-21) or LNCX-Myr-Akt were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium without serum for 72 h, after which the viable cells were counted. The cell survival rate was expressed as percentage of viable cells that has been cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 1% horse serum. Furthermore, the above mentioned clones were UV-irradiated (32 J/m2), and after 24 h, the viable cells were counted. The data are presented as percentage of viable cells in a control culture without radiation. The results are the mean ± S.E. of three independent experiments. Data from the studies described above demonstrate the impact of PI 3-kinase/PDK1/Akt on the luciferase reporter construct driven by Bcl-2 promoter. To confirm the role of Akt in the up-regulation of endogenous Bcl-2 expression, we used the PC12 cell line overexpressing constitutively active myristoylated Akt. We measured Bcl-2 mRNA levels in these cells by a sensitive real-time quantitative RT-PCR using the TaqManTM fluorogenic probe system. Applied Biosystems prism model 7700 sequence detection instrument was used to measure the reporter fluorescence emission. As shown in Fig.3 D, there is a 2.1-fold increase in Bcl-2 mRNA level in Akt clone as compared with the control vector-only clone. Treatment of these cells with 100 ng/ml IGF-I increased the Bcl-2 mRNA level further to 3.0-fold, which could be due to IGF-I action through p38β MAPK (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar). This experiment clearly provides a physiological relevance to the significance of Akt-mediated CREB activation. Great insight has been gained over the recent few years regarding the mechanism of neuronal programmed cell death and the ability of growth factors to serve as anti-apoptotic agents. The majority of the data has suggested post-translational modification of the apoptotic machinery (7.Datta S.R. Dudek H. Tao X. Masters S. Fu H. Gotoh Y. Greenberg M.E. Cell. 1997; 91: 231-241Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (5003) Google Scholar). The importance of PI 3-kinase and Akt for these effects has been reported by a number of groups (3.Dudek H. Datta S.R. Franke T.F. Birnbaum M.J. Yao R. Cooper G.M. Segal R.A. Kaplan D.R. Greenberg M.E. Science. 1997; 275: 661-664Crossref PubMed Scopus (2245) Google Scholar, 4.Kulik G. Klippel A. Weber M.J. Mol. Cell. Biol. 1997; 17: 1595-1606Crossref PubMed Scopus (968) Google Scholar). The present study defines an additional critical regulatory function for Akt involving transcriptional regulation of the anti-apoptotic protein Bcl-2. We recently reported the induction of Bcl-2 by IGF-I through a novel signaling pathway mediated by MAP kinase kinase 6/p38β MAP kinase/MAP kinase-activated protein kinase-3 (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar). Now we identify an additional pathway involving Akt for IGF-I-mediated activation of Bcl-2 promoter. Regulation of neuronal survival by growth factors is known to proceed through the PI 3-kinase-mediated signaling (3.Dudek H. Datta S.R. Franke T.F. Birnbaum M.J. Yao R. Cooper G.M. Segal R.A. Kaplan D.R. Greenberg M.E. Science. 1997; 275: 661-664Crossref PubMed Scopus (2245) Google Scholar). Low potassium-induced apoptosis in cerebellar granule neurons has been shown to be prevented by synthetic lipid products of PI 3-kinase when added to the culture medium (24.Shimoke K. Yamada M. Ikeuchi T. Hatanaka H. FEBS Lett. 1998; 437: 221-224Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar). Downstream of this kinase, two signaling pathways involving Akt and p70 s6k have been identified. Dudek et al.(3.Dudek H. Datta S.R. Franke T.F. Birnbaum M.J. Yao R. Cooper G.M. Segal R.A. Kaplan D.R. Greenberg M.E. Science. 1997; 275: 661-664Crossref PubMed Scopus (2245) Google Scholar) show that dominant negative Akt is able to induce apoptosis in rat cerebellar granular neurons, and rapamycin, an inhibitor of p70 s6 kinase, does not block insulin-mediated promotion of cell survival (3.Dudek H. Datta S.R. Franke T.F. Birnbaum M.J. Yao R. Cooper G.M. Segal R.A. Kaplan D.R. Greenberg M.E. Science. 1997; 275: 661-664Crossref PubMed Scopus (2245) Google Scholar). Expression of a myristoylated Akt, the active form in immortalized rat hippocampal neuronal cells, leads to increased survival against apoptotic signal (25.Eves E.M. Xiong W. Bellacosa A. Kennedy S.G. Tsichlis P.N. Rosner M.R. Hay N. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 2143-2152Crossref PubMed Scopus (176) Google Scholar). Akt-mediated phosphorylation of cytosolic proteins such as glycogen synthase kinase-3 and Bad is known to play a critical role in the regulation of metabolic pathways as well as prevention of cell death by insulin and growth factors (7.Datta S.R. Dudek H. Tao X. Masters S. Fu H. Gotoh Y. Greenberg M.E. Cell. 1997; 91: 231-241Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (5003) Google Scholar). Recent studies indicate that Akt can regulate gene expression at the transcriptional level, suggesting a nuclear site of action. Akt increases the expression of GLUT1 in hepatoma cells (26.Barthel A. Okino S.T. Liao J. Nakatani K. Li J. Whitlock Jr., J.P. Roth R.A. J. Biol. Chem. 1999; 274: 20281-20286Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (263) Google Scholar) and leptin in adipocytes (27.Barthel A. Kohn A.D. Luo Y. Roth R.A. Endocrinology. 1997; 138: 3559-3562Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar). Interleukin-2-mediated Akt activation in BAF/3 cells results in increased expression of Bcl-2. Furthermore, forkhead transcription factor has been identified as a nuclear target for Akt (28.Tang E.D. Nunez G. Barr F.G. Guan K.-L. J. Biol. Chem. 1999; 274: 16741-16746Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (669) Google Scholar, 29.Rena G. Guo S. Cichy S.C. Unterman T.G. Cohen P. J. Biol. Chem. 1999; 274: 17179-17183Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (622) Google Scholar, 30.Guo S. Rena G. Cichy S. He X. Cohen P. Unterman T. J. Biol. Chem. 1999; 274: 17184-17192Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (475) Google Scholar, 31.Biggs W.H. Meisenhelder J. Hunter T. Cavenee W.K. Arden K.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 7421-7426Crossref PubMed Scopus (955) Google Scholar, 32.Brunet A. Bonni A. Zigmond M.J. Lin M.Z. Juo P. Hu L.S. Anderson M.J. Arden K.C. Blenis J. Greenberg M.E. Cell. 1999; 96: 857-868Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (5526) Google Scholar). It is known to induce insulin-like growth factor-binding protein-1 by stimulating its promoter activity. Akt has been shown to phosphorylate forkhead transcription factor at Thr-24, Ser-256, and Ser-319, the consensus phosphorylation sites both in vitro and in vivo (29.Rena G. Guo S. Cichy S.C. Unterman T.G. Cohen P. J. Biol. Chem. 1999; 274: 17179-17183Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (622) Google Scholar). This covalent modification leads to the nuclear exclusion of forkhead transcription factor, leading to negative regulation of forkhead transcription factor -responsive genes by Akt (28.Tang E.D. Nunez G. Barr F.G. Guan K.-L. J. Biol. Chem. 1999; 274: 16741-16746Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (669) Google Scholar). Studies have indeed shown that this protein kinase can translocate to nucleus (33.Andjelkovic M. Alessi D.R. Meier R. Fernandez A. Lamb N.J.C. Frech M. Cron P. Cohen P. Lucocq J.M. Hemmings B.A. J. Biol. Chem. 1997; 272: 31515-31524Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (907) Google Scholar, 34.Meier R. Alessi D.R. Cron P. Andjelkovic M. Hemmings B.A. J. Biol. Chem. 1997; 272: 30491-30497Crossref PubMed Scopus (331) Google Scholar, 35.Ahmed N.N. Franke T.F. Bellacosa A. Datta K. Gonzalez-Portal M.-E. Taguchi T. Testa J.R. Tsichlis P.N. Oncogene. 1993; 8: 1957-1963PubMed Google Scholar). Akt/protein kinase B is first translocated to the plasma membrane, where it is activated following phosphorylation on Thr-308 and Ser-473. Subsequently, Akt can be translocated to the nucleus. Meier et al. have demonstrated by confocal microscopy the nuclear translocation of Akt 20–30 min after mitogenic stimulation (34.Meier R. Alessi D.R. Cron P. Andjelkovic M. Hemmings B.A. J. Biol. Chem. 1997; 272: 30491-30497Crossref PubMed Scopus (331) Google Scholar). Significant to our present study, it has been demonstrated that myristoylated Akt, which is membrane-directed, can also undergo partial nuclear localization (35.Ahmed N.N. Franke T.F. Bellacosa A. Datta K. Gonzalez-Portal M.-E. Taguchi T. Testa J.R. Tsichlis P.N. Oncogene. 1993; 8: 1957-1963PubMed Google Scholar), whereas Akt construct having both myristoylation and palmitoylation signals does not (34.Meier R. Alessi D.R. Cron P. Andjelkovic M. Hemmings B.A. J. Biol. Chem. 1997; 272: 30491-30497Crossref PubMed Scopus (331) Google Scholar). The probable explanation for the difference seems to be that they anchor to the plasma membrane with different levels of affinity. We were able to observe increased CREB activity in PC12 cells expressing Akt with a myristoylation signal (Fig.3 C). The transcription factor CREB has also been identified as a target for several signaling pathways mediated by growth factors. Nerve growth factor is known to increase CREB phosphorylation through Ras/MAP kinase kinase/extracellular-regulated kinase/Rsk2 (36.Xing J. Ginty D.D. Greenberg M.E. Science. 1996; 273: 959-963Crossref PubMed Scopus (1094) Google Scholar). Fibroblast growth factor and IGF-I induce CRE site- containing promoters by activating p38 MAPK and MAPKAP-K2/3 (13.Pugazhenthi S. Miller E. Sable C. Young P. Heidenreich K.A. Boxer L.M. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27529-27535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (183) Google Scholar, 37.Tan Y. Rouse J. Zhang A. Cariati S. Cohen P. Comb M.J. EMBO J. 1996; 15: 4629-4642Crossref PubMed Scopus (571) Google Scholar). IGF-I-stimulated CREB phosphorylation in PC12 cells is decreased by wortmannin, an inhibitor of PI 3-kinase, but not by rapamycin, an inhibitor of p70 s6k, suggesting that Akt is likely to be involved in CREB activation (16.Pugazhenthi S. Boras T. O'Connor D. Meintzer M.K. Heidenreich K.A. Reusch J.E.-B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2829-2837Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (109) Google Scholar). In a recent study, Du and Montminy (15.Du K. Montminy M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 32377-32379Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (835) Google Scholar) demonstrated that Akt/protein kinase B stimulates the phosphorylation of CREB on serine 133 and promotes the recruitment of the coactivator CREB-binding protein (15.Du K. Montminy M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 32377-32379Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (835) Google Scholar). They also showed that Akt-mediated induction of CRE-driven gene expression is blocked by a serine to alanine mutation at position 133 using the Gal4 CREB system. In the present investigation, we further demonstrate the physiological importance of this signaling pathway in the activation of an endogenous CRE site-containing Bcl-2 promoter. When the luciferase reporter construct driven by Bcl-2 promoter was cotransfected with p110, PDK1, and Akt, there was significant stimulation of basal and IGF-I-induced luciferase activity. The dominant negative forms of the regulatory subunit of PI 3-kinase, Δp85, and Akt were able to decrease the promoter activity, suggesting that growth factor-mediated signaling through PI 3-kinase/PDK1/Akt could be involved in the induction of Bcl-2 expression. Hence Akt seems to promote cell survival through inactivation of Bad by phosphorylation and up-regulation of Bcl-2 by transcriptional activation. We thank Dr. Nicholas Webster, Dr. Emmanuel Van Obberghen, and Dr. Richard Goodman for providing valuable reagents. We acknowledge the excellent secretarial support of Gloria Smith. We thank Dr. Boris Draznin for critically reading the manuscript. Quantitative RT-PCR was performed at the University of Colorado Cancer Center core facility.

Phospholipase A2 (PLA2) is the enzyme regulating the release of arachidonic acid in most cell types. A high molecular mass, 85-kDa soluble form of PLA2 (cPLA2) has recently been identified, the activity of which is stably increased by stimulation of cells with hormones and growth factors. Growth factor stimulation of cells has been reported to result in increased phosphorylation of cPLA2 on serine residues, but the kinases mediating this effect have not been identified. We report here that human cPLA2 is phosphorylated in vitro by two growth factor-stimulated serine/threonine-specific kinases, p42 MAP kinase and protein kinase C (PKC). Phosphorylation of the cPLA2 enzyme by either kinase results in an increase in catalytic cPLA2-specific activity. Domains of the cPLA2 molecule have been expressed in Escherichia coli, and the fusion proteins purified. PKC and p42 MAP kinase give different patterns of phosphorylation of the recombinantly expressed cPLA2 fragments. p42 MAP kinase selectively phosphorylates the domain of cPLA2 containing a MAP kinase consensus sequence, whereas PKC phosphorylates sites in all three recombinantly expressed domains of the enzyme. Peptide mapping indicates that the site phosphorylated by p42 MAP kinase is different from those phosphorylated by PKC. The combined action of both of these kinases is likely to mediate the effects of growth factor stimulation on arachidonic acid release through the activation of cPLA2.

Despite initial and often dramatic responses of epidermal growth factor receptor (EGFR)-addicted lung tumors to the EGFR-specific tyrosine kinase inhibitors (TKIs), gefitinib and erlotinib, nearly all develop resistance and relapse. To explore novel mechanisms mediating acquired resistance, we employed non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines bearing activating mutations in EGFR and rendered them resistant to EGFR-specific TKIs through chronic adaptation in tissue culture. In addition to previously observed resistance mechanisms including EGFR-T790M 'gate-keeper' mutations and MET amplification, a subset of the seven chronically adapted NSCLC cell lines including HCC4006, HCC2279 and H1650 cells exhibited marked induction of fibroblast growth factor (FGF) 2 and FGF receptor 1 (FGFR1) mRNA and protein. Also, adaptation to EGFR-specific TKIs was accompanied by an epithelial to mesenchymal transition (EMT) as assessed by changes in CDH1, VIM, ZEB1 and ZEB2 expression and altered growth properties in Matrigel. In adapted cell lines exhibiting increased FGF2 and FGFR1 expression, measures of growth and signaling, but not EMT, were blocked by FGFR-specific TKIs, an FGF-ligand trap and FGFR1 silencing with RNAi. In parental HCC4006 cells, cell growth was strongly inhibited by gefitinib, although drug-resistant clones progress within 10 days. Combined treatment with gefitinib and AZD4547, an FGFR-specific TKI, prevented the outgrowth of drug-resistant clones. Thus, induction of FGF2 and FGFR1 following chronic adaptation to EGFR-specific TKIs provides a novel autocrine receptor tyrosine kinase-driven bypass pathway in a subset of lung cancer cell lines that are initially sensitive to EGFR-specific TKIs. The findings support FGFR-specific TKIs as potentially valuable additions to existing targeted therapeutic strategies with EGFR-specific TKIs to prevent or delay acquired resistance in EGFR-driven NSCLC.

Purpose: Radiotherapy (RT) can transform the immune landscape and render poorly immunogenic tumors sensitive to PD-L1 inhibition. Here, we established that the response to combined RT and PD-L1 inhibition is transient and investigated mechanisms of resistance.Experimental Design: Mechanisms of resistance to RT and PD-L1 blockade were investigated in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) tumors using mass cytometry and whole-genome sequencing. Mice were treated with anti-PD-L1 or anti-TIM-3 alone and in combination with and without RT. Tumor growth and survival were assessed. Flow cytometry was used to assess phenotypic and functional changes in intratumoral T-cell populations. Depletion of regulatory T cells (Treg) was performed using anti-CD25 antibody.Results: We show that the immune checkpoint receptor, TIM-3, is upregulated on CD8 T cells and Tregs in tumors treated with RT and PD-L1 blockade. Treatment with anti-TIM-3 concurrently with anti-PD-L1 and RT led to significant tumor growth delay, enhanced T-cell cytotoxicity, decreased Tregs, and improved survival in orthotopic models of HNSCC. Despite this treatment combination, the response was not durable, and analysis of relapsed tumors revealed resurgence of Tregs. Targeted Treg depletion, however, restored antitumor immunity in mice treated with RT and dual immune checkpoint blockade and resulted in tumor rejection and induction of immunologic memory.Conclusions: These data reveal multiple layers of immune regulation that can promote tumorigenesis and the therapeutic potential of sequential targeting to overcome tumor resistance mechanisms. We propose that targeted Treg inhibitors may be critical for achieving durable tumor response with combined radiotherapy and immunotherapy. Clin Cancer Res; 24(21); 5368-80. ©2018 AACR.

Abstract Introduction In patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), the prognostic significance of the tumor microenvironment (TME) immune composition has been demonstrated using single or dual-marker staining on sequential tissue sections. While these studies show that relative abundance and localization of immune cells are important parameters, deeper analyses of the NSCLC TME are necessary to refine the potential application of these findings to clinical care. Currently, the complex spatial relationships between cells of the NSCLC TME and potential drivers contributing to its immunologic composition remain unknown. Methods We employed multispectral quantitative imaging on the lung adenocarcinoma TME in 153 patients with resected tumors. On a single slide per patient, we evaluated the TME with markers for CD3, CD8, CD14, CD19, major histocompatibility complex II (MHCII), cytokeratin, and DAPI. Image analysis including tissue segmentation, phenotyping, and spatial localization were performed. Results Specimens where ≥5% of lung cancer cells expressed MHCII (MHCII hi TME) demonstrated increased levels of CD4 + and CD8 + T cell and CD14 + cell infiltration. In the MHCII hi TME, the immune infiltrate was closer to cancer cells and expressed an activated phenotype. Morphologic image analysis revealed cancer cells in the MHCII hi TME more frequently interfaced with CD4 + and CD8 + T cells. Patients with an MHCII hi TME experienced improved overall survival (p=0.046). Conclusions Lung cancer cell-specific expression of MHCII associates with levels of immune cell infiltration, spatial localization, and activation status within the TME. This suggest cancer cell-specific expression of MHCII may represent a biomarker for the immune system’s recognition and activation against the tumor.

Abstract Purpose Lung cancers bearing oncogenic EML4-ALK fusions respond to targeted tyrosine kinase inhibitors (TKIs; e.g. alectinib), with variation in the degree of shrinkage and duration of treatment (DOT). We previously demonstrated a positive association of a TKI-induced interferon gamma (IFNγ) transcriptional response with DOT in EGFR-mutant lung cancers. Herein, we used murine models of EML4-ALK lung cancer to test a role for host immunity in the therapeutic response to alectinib. Experimental Design Three murine EML4-ALK cell lines (EA1, EA2, EA3) were implanted orthotopically into the lungs of immunocompetent and immunodeficient mice and treated with alectinib. Tumor volumes were serially measured by μCT. Immune cell content was measured by flow cytometry, multispectral immunofluorescence and CyTOF. Transcriptional responses to alectinib were assessed by RNAseq and secreted chemokines were measured by ELISA. Results All cell lines were sensitive to alectinib in vitro . EA1 and EA3 tumors retained residual disease that rapidly progressed upon termination of treatment while EA2 tumors were eliminated by TKI treatment. Alectinib induced inflammatory transcriptional programs and multiple chemokines in all cell lines while untreated tumors exhibited distinct baseline chemokine expression patterns and content of CD8+ T cells and myeloid subsets. When propagated in immune-deficient mice, all three cell line-derived lung tumor models exhibited significant shrinkage followed by prompt progression despite continuous alectinib treatment. Conclusions The findings support an hypothesis that host and TKI-stimulated production of chemokines by tumor cells promotes functional engagement of adaptive immune cells within the tumor microenvironment that enhances the durability and depth of TKI response. Statement of Translational Relevance Patients with metastatic lung cancer harboring ALK fusions are treated with targeted tyrosine kinase inhibitors (TKI) in the first line setting. Despite bearing the same driver oncogene, patients experience a range of tumor burden reduction and variable amounts of residual disease. Residual disease burden associates with patient survival and contributes to the emergence of drug resistance yielding treatment failure. The factors mediating this differential response to TKI and residual disease are incompletely understood. Our group has developed a panel of murine ALK driven lung cancer cell lines that reproducibly show differences in the depth and duration of response when implanted into immunocompetent mice. Data using this model indicate that the presence of CD8+ T cells is a major contributor to the depth and duration of response. These models will be critical in developing rational combination therapies to augment the immune microenvironment engagement along with TKIs to improve outcomes for these patients.

Abstract The KRAS(G12C) mutation is the most common genetic mutation in North American lung adenocarcinoma patients. Recently, direct inhibitors of the KRAS G12C protein have been developed and demonstrate clinical response rates of 37-43%. Importantly, these agents fail to generate durable therapeutic responses with median progression-free survival of ~6.5 months. To provide models for further preclinical improvement of these inhibitors, we generated three novel murine KRAS G12C -driven lung cancer cell lines. The co-occurring NRAS Q61L mutation in KRAS G12C -positive LLC cells was deleted and the KRAS G12V allele in CMT167 cells was edited to KRAS G12C with CRISPR/Cas9 methods. Also, a novel murine KRAS G12C line, mKRC.1, was established from a tumor generated in a genetically-engineered mouse model. The three lines exhibit similar in vitro sensitivities to KRAS G12C inhibitors (MRTX-1257, AMG-510), but distinct in vivo responses to MRTX-849 ranging from progressive growth with orthotopic LLC-NRAS KO tumors to marked shrinkage with mKRC.1 tumors. All three cell lines exhibited synergistic in vitro growth inhibition with MRTX-1257 and the SHP2 inhibitor, RMC-4550 and the MRTX-849/RMC-4550 combination yielded tumor shrinkage in orthotopic LLC-NRAS KO tumors propagated in syngeneic mice. Notably, this synergistic combination response was lost in athymic nu/nu mice, supporting a growing literature demonstrating a role for adaptive immunity in the response to this class of drugs. These new models of murine KRAS G12C mutant lung cancer should prove valuable for identifying improved therapeutic combination strategies with KRAS G12C inhibitors. Contribution to the Field Statement The development of KRAS G12C inhibitors has not impacted treatment of lung cancers bearing the KRAS G12C mutation to the degree that tyrosine kinase inhibitors have changed the treatment outcomes for patients bearing oncogenic mutations in receptor tyrosine kinases. Thus, the field is now exploring combination strategies with KRAS G12C inhibitors that may enhance their clinical benefit. Moreover, published findings indicate that host immunity contributes to efficacy of oncogene-directed inhibitors including KRAS G12C inhibitors. Thus, these novel murine KRAS G12C -driven lung cancer cell lines will provide valuable models for preclinical evaluation of novel drug combinations in immune competent hosts.

Abstract MHC class II (MHCII) expression is usually restricted to antigen presenting cells, but can be expressed by cancer cells. We examined the effect of cancer cell-intrinsic MHC class II (csMHCII) expression in lung adenocarcinoma on T cell recruitment to tumors and response to anti-PD-1 therapy. The functional significance of altering csMHCII expression was explored using two orthotopic immunocompetent murine models of non-small cell lung cancer: CMT167 (CMT) and Lewis Lung Carcinoma (LLC). We previously showed that CMT167 tumors are eradicated by anti-PD1 therapy, while LLC tumors are resistant. RNA-seq analysis of cancer cells recovered from tumors revealed that csMHCII correlated with response to anti-PD1 therapy, with immunotherapy-sensitive CMT167 cells being csMHCII positive, while resistant LLC cells were csMHCII negative. To test the functional effects of csMHCII, MHCII expression was altered on the cancer cells through loss- and gain-of-function of CIITA, a master regulator of the MHCII pathway. Loss of CIITA in CMT167 decreased csMHCII, and converted tumors from anti-PD-1-sensitive to anti-PD-1-resistant. This was associated with decreased T cell infiltration, lower levels of Th1 cytokines, increased B cell number and decreased macrophage recruitment. Conversely, overexpression of CIITA in LLC cells resulted in csMHCII in vitro and in vivo . Enforced expression of CIITA increased T cell infiltration and sensitized tumors to anti-PD-1 therapy. csMHCII expression was also examined in a subset of surgically resected human lung adenocarcinomas by multispectral imaging, provided a survival benefit and positively correlated with T cell infiltration. These studies demonstrate a functional role for csMHCII in regulating T cell infiltration and sensitivity to anti-PD-1.