Sm-like proteins are highly conserved proteins that form the core of the U6 ribonucleoprotein and function in several mRNA metabolism processes, including pre-mRNA splicing. Despite their wide occurrence in all eukaryotes, little is known about the roles of Sm-like proteins in the regulation of splicing. Here, through comprehensive transcriptome analyses, we demonstrate that depletion of the Arabidopsis supersensitive to abscisic acid and drought 1 gene (SAD1), which encodes Sm-like protein 5 (LSm5), promotes an inaccurate selection of splice sites that leads to a genome-wide increase in alternative splicing. In contrast, overexpression of SAD1 strengthens the precision of splice-site recognition and globally inhibits alternative splicing. Further, SAD1 modulates the splicing of stress-responsive genes, particularly under salt-stress conditions. Finally, we find that overexpression of SAD1 in Arabidopsis improves salt tolerance in transgenic plants, which correlates with an increase in splicing accuracy and efficiency for stress-responsive genes. We conclude that SAD1 dynamically controls splicing efficiency and splice-site recognition in Arabidopsis, and propose that this may contribute to SAD1-mediated stress tolerance through the metabolism of transcripts expressed from stress-responsive genes. Our study not only provides novel insights into the function of Sm-like proteins in splicing, but also uncovers new means to improve splicing efficiency and to enhance stress tolerance in a higher eukaryote.

Drought, high salinity and freezing impose osmotic stress on plants. Plants respond to the stress in part by modulating gene expression, which eventually leads to the restoration of cellular homeostasis, detoxification of toxins and recovery of growth. The signal transduction pathways mediating these adaptations can be dissected by combining forward and reverse genetic approaches with molecular, biochemical and physiological studies. Arabidopsis is a useful genetic model system for this purpose and its relatives including the halophyte Thellungiella halophila, can serve as valuable complementary genetic model systems.

A large genetic screen for sos (for salt overly sensitive) mutants was performed in an attempt to isolate mutations in any gene with an sos phenotype. Our search yielded 28 new alleles of sos1, nine mutant alleles of a newly identified locus, SOS2, and one allele of a third salt tolerance locus, SOS3. The sos2 mutations, which are recessive, were mapped to the lower arm of chromosome V, ~2.3 centimorgans away from the marker PHYC. Growth measurements demonstrated that sos2 mutants are specifically hypersensitive to inhibition by Na+ or Li+ and not hypersensitive to general osmotic stresses. Interestingly, the SOS2 locus is also necessary for K+ nutrition because sos2 mutants were unable to grow on a culture medium with a low level of K+. The expression of several salt-inducible genes was superinduced in sos2 plants. The salt tolerance of sos1, sos2, and sos3 mutants correlated with their K+ tissue content but not their Na+ tissue content. Double mutant analysis indicated that the SOS genes function in the same pathway. Based on these results, a genetic model for salt tolerance mechanisms in Arabidopsis is presented in which SOS1, SOS2, and SOS3 are postulated to encode regulatory components controlling plant K+ nutrition that in turn is essential for salt tolerance.

To understand low temperature and osmotic stress signaling in plants, we isolated and characterized two allelic Arabidopsis mutants, los5-1 and los5-2, which are impaired in gene induction by cold and osmotic stresses. Expression of RD29A-LUC (the firefly luciferase reporter gene under the control of the stress-responsive RD29A promoter) in response to cold and salt/drought is reduced in the los5 mutants, but the response to abscisic acid (ABA) remains unaltered. RNA gel blot analysis indicates that the los5 mutation reduces the induction of several stress-responsive genes by cold and severely diminishes or even completely blocks the induction of RD29A, COR15, COR47, RD22, and P5CS by osmotic stresses. los5 mutant plants are compromised in their tolerance to freezing, salt, or drought stress. los5 plants are ABA deficient, as indicated by increased transpirational water loss and reduced accumulation of ABA under drought stress in the mutant. A comparison with another ABA-deficient mutant, aba1, reveals that the impaired low-temperature gene regulation is specific to the los5 mutation. Genetic tests suggest that los5 is allelic to aba3. Map-based cloning reveals that LOS5/ABA3 encodes a molybdenum cofactor (MoCo) sulfurase. MoCo sulfurase catalyzes the generation of the sulfurylated form of MoCo, a cofactor required by aldehyde oxidase that functions in the last step of ABA biosynthesis in plants. The LOS5/ABA3 gene is expressed ubiquitously in different plant parts, and the expression level increases in response to drought, salt, or ABA treatment. Our results show that LOS5/ABA3 is a key regulator of ABA biosynthesis, stress-responsive gene expression, and stress tolerance.

To dissect genetically the complex network of osmotic and cold stress signaling, we constructed lines of Arabidopsis plants displaying bioluminescence in response to low temperature, drought, salinity, and the phytohormone abscisic acid (ABA). This was achieved by introducing into Arabidopsis plants a chimeric gene construct consisting of the firefly luciferase coding sequence (LUC) under the control of the stress-responsive RD29A promoter. LUC activity in the transgenic plants, as assessed by using in vivo luminescence imaging, faithfully reports the expression of the endogenous RD29A gene. A large number of cos (for constitutive expression of osmotically responsive genes), los (for low expression of osmotically responsive genes), and hos (for high expression of osmotically responsive genes) mutants were identified by using a high-throughput luminescence imaging system. The los and hos mutants were grouped into 14 classes according to defects in their responses to one or a combination of stress and ABA signals. Based on the classes of mutants recovered, we propose a model for stress signaling in higher plants. Contrary to the current belief that ABA-dependent and ABA-independent stress signaling pathways act in a parallel manner, our data reveal that these pathways cross-talk and converge to activate stress gene expression.

Low temperature is one of the most important environmental stimuli that control gene transcription programs and development in plants. In Arabidopsis thaliana , the HOS1 locus is a key negative regulator of low temperature-responsive gene transcription. The recessive hos1 mutation causes enhanced induction of the CBF transcription factors by low temperature as well as of their downstream cold-responsive genes. The hos1 mutant plants flower early, and this correlates with a low level of Flowering Locus C gene expression. The HOS1 gene was isolated through positional cloning. HOS1 encodes a novel protein with a RING finger motif near the amino terminus. HOS1 is ubiquitously expressed in all plant tissues. HOS1–GFP translational fusion studies reveal that HOS1 protein resides in the cytoplasm at normal growth temperatures. However, in response to low temperature treatments, HOS1 accumulates in the nucleus. Ectopic expression of HOS1 in wild-type plants causes cosuppression of HOS1 expression and mimics the hos1 mutant phenotypes.

Drought and high salinity induce the expression of many plant genes. To understand the signal transduction mechanisms underlying the activation of these genes, we carried out a genetic screen to isolate Arabidopsis mutants defective in osmotic stress-regulated gene induction. Here we report the isolation, characterization, and cloning of a mutation, los6, which diminished osmotic stress activation of a reporter gene. RNA blot analysis indicates that under osmotic stress the transcript levels for stress-responsive genes such as RD29A, COR15A,KIN1, COR47, RD19, andADH are lower in los6 plants than in wild type plants. los6 plants were found to have reduced phytohormone abscisic acid (ABA) accumulation and to be allelic to the ABA-deficient mutant, aba1. LOS6/ABA1 encodes a zeaxanthin epoxidase that functions in ABA biosynthesis. Its expression is enhanced by osmotic stress. Furthermore, we found that there exists a positive feedback regulation by ABA on the expression of LOS6/ABA1, which may underscore a quick adaptation strategy for plants under osmotic stress. Similar positive regulation by ABA also exists for other ABA biosynthesis genes AAO3 and LOS5/ABA3 and in certain genetic backgrounds, NCED3. This feedback regulation by ABA is impaired in the ABA-insensitive mutantabi1 but not in abi2. Moreover, the up-regulation of LOS6/ABA1, LOS5/ABA3,AAO3, and NCED3 by osmotic stress is reduced substantially in ABA-deficient mutants. Transgenic plants overexpressing LOS6/ABA1 showed an increasedRD29A-LUC expression under osmotic stress. These results suggest that the level of gene induction by osmotic stress is dependent on the dosage of the zeaxanthin epoxidase enzyme. Drought and high salinity induce the expression of many plant genes. To understand the signal transduction mechanisms underlying the activation of these genes, we carried out a genetic screen to isolate Arabidopsis mutants defective in osmotic stress-regulated gene induction. Here we report the isolation, characterization, and cloning of a mutation, los6, which diminished osmotic stress activation of a reporter gene. RNA blot analysis indicates that under osmotic stress the transcript levels for stress-responsive genes such as RD29A, COR15A,KIN1, COR47, RD19, andADH are lower in los6 plants than in wild type plants. los6 plants were found to have reduced phytohormone abscisic acid (ABA) accumulation and to be allelic to the ABA-deficient mutant, aba1. LOS6/ABA1 encodes a zeaxanthin epoxidase that functions in ABA biosynthesis. Its expression is enhanced by osmotic stress. Furthermore, we found that there exists a positive feedback regulation by ABA on the expression of LOS6/ABA1, which may underscore a quick adaptation strategy for plants under osmotic stress. Similar positive regulation by ABA also exists for other ABA biosynthesis genes AAO3 and LOS5/ABA3 and in certain genetic backgrounds, NCED3. This feedback regulation by ABA is impaired in the ABA-insensitive mutantabi1 but not in abi2. Moreover, the up-regulation of LOS6/ABA1, LOS5/ABA3,AAO3, and NCED3 by osmotic stress is reduced substantially in ABA-deficient mutants. Transgenic plants overexpressing LOS6/ABA1 showed an increasedRD29A-LUC expression under osmotic stress. These results suggest that the level of gene induction by osmotic stress is dependent on the dosage of the zeaxanthin epoxidase enzyme. abscisic acid zeaxanthin epoxidase polyethylene glycol 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase(s) polyethylene glycol wild type Osmotic stress resulting from either high salinity or water deficit induces the expression of numerous stress-responsive genes in plants (1Hasegawa P.M. Bressan R.A. Zhu J.K. Bohnert H.J. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000; 51: 463-499Crossref PubMed Scopus (3541) Google Scholar, 2Bray E.A. Plant Physiol. 1993; 103: 1035-1040Crossref PubMed Scopus (660) Google Scholar, 3Ingram J. Bartel D. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996; 47: 377-403Crossref PubMed Scopus (1757) Google Scholar, 4Shinozaki K. Yamaguchi-Shinozaki K. Plant Physiol. 1997; 115: 327-334Crossref PubMed Scopus (889) Google Scholar, 5Zhu J.K. Hasegawa P.M. Bressan R.A. Crit. Rev. Plant Sci. 1997; 16: 253-277Crossref Scopus (328) Google Scholar). Understanding the mechanisms that regulate the expression of these genes is a fundamental issue in basic plant biology and is instrumental for future genetic improvement of plant productivity under abiotic stresses. Considerable information has been accumulated as a result of molecular studies of gene regulation under osmotic stress (1Hasegawa P.M. Bressan R.A. Zhu J.K. Bohnert H.J. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000; 51: 463-499Crossref PubMed Scopus (3541) Google Scholar, 2Bray E.A. Plant Physiol. 1993; 103: 1035-1040Crossref PubMed Scopus (660) Google Scholar, 3Ingram J. Bartel D. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996; 47: 377-403Crossref PubMed Scopus (1757) Google Scholar, 4Shinozaki K. Yamaguchi-Shinozaki K. Plant Physiol. 1997; 115: 327-334Crossref PubMed Scopus (889) Google Scholar, 5Zhu J.K. Hasegawa P.M. Bressan R.A. Crit. Rev. Plant Sci. 1997; 16: 253-277Crossref Scopus (328) Google Scholar). In contrast, genetic analysis of osmotic signal transduction has been very limited. Because the phytohormone abscisic acid (ABA)1 is known to be involved in plant responses to various environmental stresses, the availability of ABA-deficient mutants (aba) or ABA-insensitive mutants (abi) in Arabidopsis has provided invaluable opportunities to investigate the role of ABA in plant stress responses. Using these mutants, changes in transcript levels of a few stress-responsive genes were analyzed under cold, drought, or salt stress (for reviews, see Refs. 3Ingram J. Bartel D. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996; 47: 377-403Crossref PubMed Scopus (1757) Google Scholar, 4Shinozaki K. Yamaguchi-Shinozaki K. Plant Physiol. 1997; 115: 327-334Crossref PubMed Scopus (889) Google Scholar, and 6Thomashow M.F. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999; 50: 571-599Crossref PubMed Scopus (2608) Google Scholar). A general consensus resulting from these studies is that low temperature signaling is less influenced by ABA, whereas drought and salt stress signal transduction has both ABA-dependent and ABA-independent pathways (4Shinozaki K. Yamaguchi-Shinozaki K. Plant Physiol. 1997; 115: 327-334Crossref PubMed Scopus (889) Google Scholar, 6Thomashow M.F. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999; 50: 571-599Crossref PubMed Scopus (2608) Google Scholar).We have been using a reporter gene approach to dissect osmotic stress signal transduction networks. In this approach, Arabidopsisplants expressing the firefly luciferase gene under the control of the stress- and ABA-responsive RD29A promoter were used to screen for mutants with altered gene regulation by osmotic stress, cold, and/or ABA. In this report, we describe the isolation, cloning, and characterization of a mutation isolated in this screen. This mutation was designated as los6 (for low expression of osmotic stress-responsive genes6). Compared with wild type plants, los6 mutant plants exhibit reduced luminescence induction by osmotic stress.los6 plants were found to be ABA-deficient. Genetic analysis and cloning indicated that LOS6 is allelic toABA1 and encodes a zeaxanthin epoxidase (ZEP). Analysis ofLOS6/ABA1 gene expression reveals a very intriguing phenomenon (i.e. the expression ofLOS6/ABA1 is significantly enhanced by exogenous ABA). Importantly, in los6 mutant plants, osmotic stress up-regulation of LOS6/ABA1 is reduced severalfold, whereas the expression level under ABA treatment is similar to that of the wild type. We found similar regulation of two other ABA biosynthesis genes LOS5/ABA3 andAAO3 by ABA. These observations uncover a positive feedback loop in the regulation of expression of ABA biosynthesis genes. In addition, we found that ABA regulation of ABA biosynthesis genes is partially impaired in the ABA-insensitive mutant abi1 but not in abi2. In addition, we show that overexpression ofLOS6 leads to increased gene induction by osmotic stress. Osmotic stress resulting from either high salinity or water deficit induces the expression of numerous stress-responsive genes in plants (1Hasegawa P.M. Bressan R.A. Zhu J.K. Bohnert H.J. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000; 51: 463-499Crossref PubMed Scopus (3541) Google Scholar, 2Bray E.A. Plant Physiol. 1993; 103: 1035-1040Crossref PubMed Scopus (660) Google Scholar, 3Ingram J. Bartel D. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996; 47: 377-403Crossref PubMed Scopus (1757) Google Scholar, 4Shinozaki K. Yamaguchi-Shinozaki K. Plant Physiol. 1997; 115: 327-334Crossref PubMed Scopus (889) Google Scholar, 5Zhu J.K. Hasegawa P.M. Bressan R.A. Crit. Rev. Plant Sci. 1997; 16: 253-277Crossref Scopus (328) Google Scholar). Understanding the mechanisms that regulate the expression of these genes is a fundamental issue in basic plant biology and is instrumental for future genetic improvement of plant productivity under abiotic stresses. Considerable information has been accumulated as a result of molecular studies of gene regulation under osmotic stress (1Hasegawa P.M. Bressan R.A. Zhu J.K. Bohnert H.J. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000; 51: 463-499Crossref PubMed Scopus (3541) Google Scholar, 2Bray E.A. Plant Physiol. 1993; 103: 1035-1040Crossref PubMed Scopus (660) Google Scholar, 3Ingram J. Bartel D. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996; 47: 377-403Crossref PubMed Scopus (1757) Google Scholar, 4Shinozaki K. Yamaguchi-Shinozaki K. Plant Physiol. 1997; 115: 327-334Crossref PubMed Scopus (889) Google Scholar, 5Zhu J.K. Hasegawa P.M. Bressan R.A. Crit. Rev. Plant Sci. 1997; 16: 253-277Crossref Scopus (328) Google Scholar). In contrast, genetic analysis of osmotic signal transduction has been very limited. Because the phytohormone abscisic acid (ABA)1 is known to be involved in plant responses to various environmental stresses, the availability of ABA-deficient mutants (aba) or ABA-insensitive mutants (abi) in Arabidopsis has provided invaluable opportunities to investigate the role of ABA in plant stress responses. Using these mutants, changes in transcript levels of a few stress-responsive genes were analyzed under cold, drought, or salt stress (for reviews, see Refs. 3Ingram J. Bartel D. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996; 47: 377-403Crossref PubMed Scopus (1757) Google Scholar, 4Shinozaki K. Yamaguchi-Shinozaki K. Plant Physiol. 1997; 115: 327-334Crossref PubMed Scopus (889) Google Scholar, and 6Thomashow M.F. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999; 50: 571-599Crossref PubMed Scopus (2608) Google Scholar). A general consensus resulting from these studies is that low temperature signaling is less influenced by ABA, whereas drought and salt stress signal transduction has both ABA-dependent and ABA-independent pathways (4Shinozaki K. Yamaguchi-Shinozaki K. Plant Physiol. 1997; 115: 327-334Crossref PubMed Scopus (889) Google Scholar, 6Thomashow M.F. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999; 50: 571-599Crossref PubMed Scopus (2608) Google Scholar). We have been using a reporter gene approach to dissect osmotic stress signal transduction networks. In this approach, Arabidopsisplants expressing the firefly luciferase gene under the control of the stress- and ABA-responsive RD29A promoter were used to screen for mutants with altered gene regulation by osmotic stress, cold, and/or ABA. In this report, we describe the isolation, cloning, and characterization of a mutation isolated in this screen. This mutation was designated as los6 (for low expression of osmotic stress-responsive genes6). Compared with wild type plants, los6 mutant plants exhibit reduced luminescence induction by osmotic stress.los6 plants were found to be ABA-deficient. Genetic analysis and cloning indicated that LOS6 is allelic toABA1 and encodes a zeaxanthin epoxidase (ZEP). Analysis ofLOS6/ABA1 gene expression reveals a very intriguing phenomenon (i.e. the expression ofLOS6/ABA1 is significantly enhanced by exogenous ABA). Importantly, in los6 mutant plants, osmotic stress up-regulation of LOS6/ABA1 is reduced severalfold, whereas the expression level under ABA treatment is similar to that of the wild type. We found similar regulation of two other ABA biosynthesis genes LOS5/ABA3 andAAO3 by ABA. These observations uncover a positive feedback loop in the regulation of expression of ABA biosynthesis genes. In addition, we found that ABA regulation of ABA biosynthesis genes is partially impaired in the ABA-insensitive mutant abi1 but not in abi2. In addition, we show that overexpression ofLOS6 leads to increased gene induction by osmotic stress.

Abstract Drought stress is a common adverse environmental condition that seriously affects crop productivity worldwide. Due to the complexity of drought as a stress signal, deciphering drought tolerance mechanisms has remained a major challenge to plant biologists. To develop new approaches to study plant drought tolerance, we searched for phenotypes conferred by drought stress and identified the inhibition of lateral root development by drought stress as an adaptive response to the stress. This drought response is partly mediated by the phytohormone abscisic acid. Genetic screens using Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) were devised, and drought inhibition of lateral root growth (dig) mutants with altered responses to drought or abscisic acid in lateral root development were isolated. Characterization of these dig mutants revealed that they also exhibit altered drought stress tolerance, indicating that this root response to drought stress is intimately linked to drought adaptation of the entire plant and can be used as a trait to access the elusive drought tolerance machinery. Our study also revealed that multiple mechanisms coexist and together contribute to whole-plant drought tolerance.

Abstract Background Accurate and comprehensive annotation of transcript sequences is essential for transcript quantification and differential gene and transcript expression analysis. Single molecule long read sequencing technologies provide improved integrity of transcript structures including alternative splicing, and transcription start and polyadenylation sites. However, accuracy is significantly affected by sequencing errors, mRNA degradation or incomplete cDNA synthesis. Results We present a new and comprehensive Arabidopsis thaliana Reference Transcript Dataset 3 (AtRTD3). AtRTD3 contains over 160k transcripts - twice that of the best current Arabidopsis transcriptome and including over 1,500 novel genes. 79% of transcripts are from Iso-seq with accurately defined splice junctions and transcription start and end sites. We developed novel methods to determine splice junctions and transcription start and end sites accurately. Mis- match profiles around splice junctions provided a powerful feature to distinguish correct splice junctions and remove false splice junctions. Stratified approaches identified high confidence transcription start/end sites and removed fragmentary transcripts due to degradation. AtRTD3 is a major improvement over existing transcriptomes as demonstrated by analysis of an Arabidopsis cold response RNA-seq time-series. AtRTD3 provided higher resolution of transcript expression profiling and identified cold- and light-induced differential transcription start and polyadenylation site usage. Conclusions AtRTD3 is the most comprehensive Arabidopsis transcriptome currently available. It improves the precision of differential gene and transcript expression, differential alternative splicing, and transcription start/end site usage from RNA-seq data. The novel methods for identifying accurate splice junctions and transcription start/end sites are widely applicable and will improve single molecule sequencing analysis from any species.