X-linked intellectual disability (XLID) is a clinically and genetically heterogeneous disorder. During the past two decades in excess of 100 X-chromosome ID genes have been identified. Yet, a large number of families mapping to the X-chromosome remained unresolved suggesting that more XLID genes or loci are yet to be identified. Here, we have investigated 405 unresolved families with XLID. We employed massively parallel sequencing of all X-chromosome exons in the index males. The majority of these males were previously tested negative for copy number variations and for mutations in a subset of known XLID genes by Sanger sequencing. In total, 745 X-chromosomal genes were screened. After stringent filtering, a total of 1297 non-recurrent exonic variants remained for prioritization. Co-segregation analysis of potential clinically relevant changes revealed that 80 families (20%) carried pathogenic variants in established XLID genes. In 19 families, we detected likely causative protein truncating and missense variants in 7 novel and validated XLID genes (CLCN4, CNKSR2, FRMPD4, KLHL15, LAS1L, RLIM and USP27X) and potentially deleterious variants in 2 novel candidate XLID genes (CDK16 and TAF1). We show that the CLCN4 and CNKSR2 variants impair protein functions as indicated by electrophysiological studies and altered differentiation of cultured primary neurons from Clcn4−/− mice or after mRNA knock-down. The newly identified and candidate XLID proteins belong to pathways and networks with established roles in cognitive function and intellectual disability in particular. We suggest that systematic sequencing of all X-chromosomal genes in a cohort of patients with genetic evidence for X-chromosome locus involvement may resolve up to 58% of Fragile X-negative cases.

Abstract Embryonic stem cells (ESCs) can differentiate into any given cell type and therefore represent a versatile model to study the link between gene regulation and differentiation. To quantitatively assess the dynamics of enhancer activity during the early stages of murine ESC differentiation, we analyzed accessible genomic regions using STARR-seq, a massively parallel reporter assay. This resulted in a genome-wide quantitative map of active mESC enhancers, in pluripotency and during the early stages of differentiation. We find that only a minority of accessible regions is active and that such regions are enriched near promoters, characterized by specific chromatin marks, enriched for distinct sequence motifs, and modeling shows that active regions can be predicted from sequence alone. Regions that change their activity upon retinoic acid-induced differentiation are more prevalent at distal intergenic regions when compared to constitutively active enhancers. Further, analysis of differentially active enhancers verified the contribution of individual TF motifs toward activity and inducibility as well as their role in regulating endogenous genes. Notably, the activity of retinoic acid receptor alpha (RARα) occupied regions can either increase or decrease upon the addition of its ligand, retinoic acid, with the direction of the change correlating with spacing and orientation of the RARα consensus motif and the co-occurrence of additional sequence motifs. Together, our genome-wide enhancer activity map elucidates features associated with enhancer activity levels, identifies regulatory regions disregarded by computational prediction tools, and provides a resource for future studies into regulatory elements in mESCs.

Neutrophils and monocytes provide a first line of defense against infections as part of the innate immune system. Here we report the integrated analysis of transcriptomic and epigenetic landscapes for circulating monocytes and neutrophils with the aim to enable downstream interpretation and functional validation of key regulatory elements in health and disease. We collected RNA-seq data, ChIP-seq of six histone modifications and of DNA methylation by bisulfite sequencing at base pair resolution from up to 6 individuals per cell type. Chromatin segmentation analyses suggested that monocytes have a higher number of cell-specific enhancer regions (4-fold) compared to neutrophils. This highly plastic epigenome is likely indicative of the greater differentiation potential of monocytes into macrophages, dendritic cells and osteoclasts. In contrast, most of the neutrophil-specific features tend to be characterized by repressed chromatin, reflective of their status as terminally differentiated cells. Enhancers were the regions where most of differences in DNA methylation between cells were observed, with monocyte-specific enhancers being generally hypomethylated. Monocytes show a substantially higher gene expression levels than neutrophils, in line with epigenomic analysis revealing that gene more active elements in monocytes. Our analyses suggest that the overexpression of c-Myc in monocytes and its binding to monocyte-specific enhancers could be an important contributor to these differences. Altogether, our study provides a comprehensive epigenetic chart of chromatin states in primary human neutrophils and monocytes, thus providing a valuable resource for studying the regulation of the human innate immune system.

BackgroundThe increasing volume and intricacy of sequencing data, along with other clinical and diagnostic data, like drug responses and measurable residual disease, creates challenges for efficient clinical comprehension and interpretation. Using paediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia (BCP-ALL) as a use case, we present an artificial intelligence (AI)-assisted clinical framework clinALL that integrates genomic and clinical data into a user-friendly interface to support routine diagnostics and reveal translational insights for hematologic neoplasia.MethodsWe performed targeted RNA sequencing in 1365 cases with haematological neoplasms, primarily paediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia (BCP-ALL) from the AIEOP-BFM ALL study. We carried out fluorescence in situ hybridization (FISH), karyotyping and arrayCGH as part of the routine diagnostics. The analysis results of these assays as well as additional clinical information were integrated into an interactive web interface using Bokeh, where the main graph is based on Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) analysis of the gene expression data. At the backend of the clinALL, we built both shallow machine learning models and a deep neural network using Scikit-learn and PyTorch respectively.FindingsBy applying clinALL, 78% of undetermined patients under the current diagnostic protocol were stratified, and ambiguous cases were investigated. Translational insights were discovered, including IKZF1plus status dependent subpopulations of BCR::ABL1 positive patients, and a subpopulation within ETV6::RUNX1 positive patients that has a high relapse frequency. Our best machine learning models, LDA and PASNET-like neural network models, achieve F1 scores above 97% in predicting patients' subgroups.InterpretationAn AI-assisted clinical framework that integrates both genomic and clinical data can take full advantage of the available data, improve point-of-care decision-making and reveal clinically relevant insights promptly. Such a lightweight and easily transferable framework works for both whole transcriptome data as well as the cost-effective targeted RNA-seq, enabling efficient and equitable delivery of personalized medicine in small clinics in developing countries.FundingGerman Ministry of Education and Research (BMBF), German Research Foundation (DFG) and Foundation for Polish Science.

Abstract Convergent transcription, that is, the collision of sense and antisense transcription, is ubiquitous in mammalian genomes and believed to diminish RNA expression. Recently, antisense transcription downstream of promoters was found to be surprisingly prevalent. However, functional characteristics of affected promoters are poorly investigated. Here we show that convergent transcription marks an unexpected positively co-regulated promoter constellation. By assessing transcriptional dynamic systems, we identified co-regulated constituent promoters connected through a distinct chromatin structure. Within these cis -regulatory domains, transcription factors can regulate both constituting promoters by binding to only one of them. Convergent promoters comprise about a quarter of all active transcript start sites and initiate 5′-overlapping antisense RNAs—an RNA class believed previously to be rare. Visualization of nascent RNA molecules reveals convergent cotranscription at these loci. Together, our results demonstrate that co-regulated convergent promoters substantially expand the cis -regulatory repertoire, reveal limitations of the transcription interference model and call for adjusting the promoter concept.