Abstract Considerable controversy surrounds the role of protein kinase C (PKC) in ischemic preconditioning (PC). Previous studies have used pharmacological agents and/or measured total myocardial PKC activity; however, no information is available regarding the effects of PC on individual isoforms in vivo. We performed a comprehensive evaluation (using Western immunoblotting) of the expression and subcellular distribution of all 11 currently known PKC isoforms in the heart of conscious rabbits subjected to four different ischemic PC protocols known to induce early and/or late PC (one, three, or six cycles of 4-minute coronary occlusion [4′O]/4-minute reperfusion [4′R]; four cycles of 5-minute occlusion [5′O]/10-minute reperfusion [10′R]). Ten PKC isoforms (α, β 1 /β 2 , γ, δ, ε, ζ, η, ι, λ, and μ) were found to be expressed in the rabbit heart. Quantitative immunoblotting demonstrated that as a subgroup, conventional PKCs (cPKCs) are more abundant than novel PKCs (nPKCs) (1445 versus 313 pg PKC/μg tissue protein, respectively) and that PKCα is the predominant isoform among the cPKCs (α, β 1 , β 2 , and γ), representing 51% of this subgroup, and PKCε is the most abundant among the nPKCs (δ, ε, ζ, and η), accounting for 62% of this subgroup. None of the ischemic PC protocols examined caused appreciable changes in total PKC activity, in the subcellular distribution of total PKC activity, or in the subcellular distribution of PKC isoforms α, β 1 /β 2 , γ, δ, ζ, ι, λ, and μ. In contrast, all PC protocols caused significant translocation of PKCε and PKCη isoforms from the cytosolic to the particulate fraction. The particulate fraction of PKCε increased in a dose-dependent fashion with the number of occlusion/reperfusion cycles performed, from 35±2% in the control group to 43±2% after one 4′O/5-minute reperfusion (5′R) cycle ( P <.05), 52±2% after three cycles ( P <.05 versus one cycle), and 66±3% after six cycles ( P <.05 versus three cycles). The particulate fraction of PKCε also increased, after four 5′O/10′R cycles, to 50±3% ( P <.05 versus control). In contrast to PKCε, the translocation of PKCη was independent of the number of occlusion/reperfusion cycles performed. The particulate fraction of PKCη increased from 67±3% in the control group to 84±2% after one 4′O/5′R cycle ( P <.05), 84±2% after three 4′O/4′R cycles ( P <.05), 86±3% after six 4′O/4′R cycles ( P <.05), and 83±2% after four 5′O/10′R cycles ( P <.05). When expressed as a percentage of control values, the increases in the particulate fraction of isoform ε were greater than those of isoform η. The effects of 4′O without reperfusion were similar to those of one cycle of 4′O/5′R, indicating that 5′R did not attenuate isoform translocation. This is the first study to demonstrate PKC translocation after ischemic PC in vivo. The results indicate that in the conscious rabbit, ischemic PC causes selective translocation of the ε and η isoforms without demonstrable changes in total myocardial PKC activity, implying that measurements of total PKC activity are not sufficiently sensitive to detect the involvement of PKC in PC. The results are consistent with the concept that the ε and η isozymes play an important role in the genesis of ischemic PC in the conscious rabbit.

The goal of this study was to interrogate the role of inducible NO synthase (iNOS) in the late phase of ischemic preconditioning (PC) in vivo . A total of 321 mice were used. Wild-type mice preconditioned 24 h earlier with six cycles of 4-min coronary occlusion/4-min reperfusion exhibited a significant ( P < 0.05) increase in myocardial iNOS protein content, iNOS activity (assessed as calcium-independent l -citrulline formation), and nitrite + nitrate tissue levels. In contrast, endothelial NOS protein content and calcium-dependent NOS activity remained unchanged. No immunoreactive neuronal NOS was detected. When wild-type mice were preconditioned 24 h earlier with six 4-min occlusion/4-min reperfusion cycles, the size of the infarcts produced by a 30-min coronary occlusion followed by 24 h of reperfusion was reduced markedly (by 67%; P < 0.05) compared with sham-preconditioned controls, indicating a late PC effect. In contrast, when mice homozygous for a null iNOS allele were preconditioned 24 h earlier with the same protocol, infarct size was not reduced. Disruption of the iNOS gene had no effect on early PC or on infarct size in the absence of PC. These results demonstrate that ( i ) the late phase of ischemic PC is associated with selective up-regulation of iNOS, and ( ii ) targeted disruption of the iNOS gene completely abrogates the infarct-sparing effect of late PC (but not of early PC), providing unequivocal molecular genetic evidence for an obligatory role of iNOS in the cardioprotection afforded by the late phase of ischemic PC. Thus, this study identifies a specific protein that mediates late PC in vivo .

Abstract Viral tracers that permit efficient retrograde targeting of projection neurons are powerful vehicles for structural and functional dissections of the neural circuit and for the treatment of brain diseases. Recombinant adeno-associated viruses (rAAVs) are the most potential candidates because they are low-toxic with high-level transgene expression and minimal host immune responses. Currently, some rAAVs based on capsid engineering for retrograde tracing have been widely used in the analysis and manipulation of neural circuits, but suffer from brain area selectivity and inefficient retrograde transduction in certain neural connections. Here, we discovered that the recombinant adeno-associated virus 11 (rAAV11) exhibits potent retrograde labeling of projection neurons with enhanced efficiency to rAAV2-retro in some neural connections. Combined with calcium recording technology, rAAV11 can be used to monitor neuronal activities by expressing Cre recombinase or calcium-sensitive functional probe. In addition, we further showed the suitability of rAAV11 for astrocyte targeting. These properties make rAAV11 a promising tool for the mapping and manipulation of neural circuits and gene therapy of some neurological and neurodegenerative disorders. Highlights Naturally occurring AAV serotype capsid exhibits robust retrograde functionality Improved distribution properties and retrograde transport efficiency Can express Cre recombinase or calcium-sensitive functional probe for neural circuits monitoring Can specifically target astrocytes

Abstract Background Hypoxia is a key feature of tumor microenvironment that can cause fundamental changes in cancer cells, and may also lead to the development of breast cancer stem cells (BCSCs) with self-renewal ability. However, the mechanism of hypoxia in inducing BCSCs is not fully understood. Methods Performing RNA sequence and bioinformatics analysis, a hypoxia specific circular RNA (circRNA), named circSTT3A, was identified in hypoxic breast cancer cells and tissues. The clinical significance of circSTT3A was investigated in breast cancer (BC) tissues and tissue array. The loss and acquisition of circSTT3A were carried out in vivo and in vitro to confirm its functional roles in BCSC stemness maintenance. HIF1α droved circSTT3A expression was evaluated by chromatin immunoprecipitation and dual luciferase reporter assays. RNA pull-down, RNA immunoprecipitation, silver staining detection, mass spectrographic analysis, co-immunoprecipitation assays and western blotting were exerted to determine circSTT3A directly binding with HSP70 and PGK1 proteins. CircSTT3A-mediated serine metabolism was determined by UHPLC-QTRAP-MS system and ELISA kit. BC mouse model was used to assess the effects of circSTT3A/Hsp70/PGK1 on tumorigenesis and chemotherapy resistance in vivo. Results A novel hypoxia specific circSTT3A was significantly upregulated in clinical breast cancer tissues, and was related to the clinical stage and poor prognosis of BC patients. The hypoxia inducible factor 1 alpha (HIF1α)-regulated circSTT3A has remarkable effect on mammosphere formation in breast cancer cells. Our work revealed that circSTT3A directly interacting with nucleotide-binding domain of heat shock protein 70 (HSP70) increases the ability of HSP70 to recruit phosphoglycerate kinase 1 (PGK1) via its substrate-binding domain, which reduces the ubiquitination of PGK1 and increases the stability of PGK1. The enhanced PGK1 catalyzes 1,3-diphosphoglycerate (1, 3-BPG) into 3-phosphoglycerate (3-PG) leading to 3-PG accumulation and increase of serine synthesis, thus to facilitate BCSC enrichment under hypoxic microenvironment. Loss of circSTT3A or PGK1 substantially induces suppression in tumor initiation and tumor growth, which dramatically increases tumor sensitivity to Doxorubicin treatment in mice. Conclusions Hypoxia induced circSTT3A/HSP70/PGK1 axis plays a critical role in maintaining BCSC properties and may be meaningful for treating patients with breast cancer.

Abstract Aims Previous studies have shown that eGDR and TyG, as indicators of insulin resistance (IR), were key risk factors for cardiovascular disease (CVD). Our study further explored the relationship between eGDR change and new‐onset CVD, and compared the predictive value of eGDR change, eGDR and TyG. Materials and Methods A total of 2895 participants without CVD at baseline from the China Health and Retirement Longitudinal Study (CHARLS) were included, using K‐means clustering and cumulative eGDR to measure eGDR change between 2012 and 2015. Cox and restricted cubic splines (RCS) regression models assessed the relationship between eGDR change and new‐onset CVD. The predictive value of TyG, eGDR and eGDR change for outcomes was evaluated using receiver operating characteristic (ROC) curves, net reclassification improvement (NRI) and integrated discrimination improvement (IDI). Results During a mean follow‐up of 4.42 years, 581 CVD cases occurred, including 389 heart disease cases and 249 stroke cases. Participants with consistently low eGDR had a higher new‐onset CVD risk (HR: 2.51, 95%CI: 2.04–3.09). A stepwise increase of outcomes was observed with the increased cumulative eGDR ( p for trend <0.001). Further analysis showed the correlation between cumulative eGDR and outcomes was linear. Compared to eGDR and TyG, cumulative eGDR exerted greater predictive effect as evaluated by area under curve, IDI and NRI. Conclusions Sustained low eGDR was related to an increased risk of new‐onset CVD in middle‐aged and elderly population. Continuous monitoring of eGDR significantly enhances the accuracy of new‐onset CVD risk stratification, which may reduce the incidence of new‐onset CVD.