Abstract Plasmodium sporozoites that are transmitted by blood-feeding female Anopheles mosquitoes invade hepatocytes for an initial round of intracellular replication, leading to the release of merozoites that invade and multiply within red blood cells. Sporozoites and merozoites share a number of proteins that are expressed by both stages, including the Apical Membrane Antigen 1 (AMA1) and the Rhoptry Neck Proteins (RONs). Although AMA1 and RONs are essential for merozoite invasion of erythrocytes during asexual blood stage replication of the parasite, their function in sporozoites is still unclear. Here we show that AMA1 interacts with RONs in mature sporozoites. By using DiCre-mediated conditional gene deletion in P. berghei , we demonstrate that loss of AMA1, RON2 or RON4 in sporozoites impairs colonization of the mosquito salivary glands and invasion of mammalian hepatocytes, without affecting transcellular parasite migration. Our data establish that AMA1 and RONs facilitate host cell invasion across Plasmodium invasive stages, and suggest that sporozoites use the AMA1-RON complex to safely enter the mosquito salivary glands without causing cell damage, to ensure successful parasite transmission. These results open up the possibility of targeting the AMA1-RON complex for transmission-blocking antimalarial strategies.

ABSTRACT Plasmodium sporozoites are transmitted to a mammalian host during blood feeding by an infected mosquito and invade hepatocytes for initial replication of the parasite in the liver. This leads to the release of thousands of merozoites into the blood circulation and initiation of the pathogenic blood stages of malaria. Merozoite invasion of erythrocytes has been well characterized at the molecular and structural levels. In sharp contrast, the molecular mechanisms of sporozoite invasion of hepatocytes are poorly characterized. Here we report a new role during sporozoite entry for the B9 protein, a member of the 6-cysteine domain protein family. Using genetic tagging and gene deletion approaches in rodent malaria parasites, we show that B9 is secreted from sporozoite micronemes and is required for productive invasion of hepatocytes. Structural modelling indicates that the N-terminus of B9 forms a beta-propeller domain structurally related to CyRPA, a cysteine-rich protein forming an invasion complex with Rh5 and RIPR in P. falciparum merozoites. We provide evidence that the beta-propeller domain of B9 is essential for protein function during sporozoite entry and interacts with P36 and P52, both also essential for productive invasion of hepatocytes. Our results suggest that, despite using distinct sets of parasite and host entry factors, Plasmodium sporozoites and merozoites may share common structural modules to assemble protein complexes for invasion of host cells.

ABSTRACT Asexual blood stages of the malaria parasite are readily amenable to genetic modification via homologous recombination, allowing functional studies of parasite genes that are not essential in this part of the life cycle. However, conventional reverse genetics cannot be applied for the functional analysis of genes that are essential during asexual blood-stage replication. Various strategies have been developed for conditional mutagenesis of Plasmodium , including recombinase-based gene deletion, regulatable promoters, and mRNA or protein destabilization systems. Among these, the dimerisable Cre (DiCre) recombinase system has emerged as a powerful approach for conditional gene targeting in P. falciparum . In this system, the bacteriophage Cre is expressed in the form of two separate, enzymatically inactive polypeptides, each fused to a different rapamycin-binding protein. Rapamycin-induced heterodimerization of the two components restores recombinase activity. We have implemented the DiCre system in the rodent malaria parasite P. berghei , and show that rapamycin-induced excision of floxed DNA sequences can be achieved with very high efficiency in both mammalian and mosquito parasite stages. This tool can be used to investigate the function of essential genes not only in asexual blood stages, but also in other parts of the malaria parasite life cycle.

Abstract Plasmodium sporozoites inoculated by Anopheles mosquitoes into the skin of the mammalian host migrate to the liver before infecting hepatocytes. Previous work demonstrated that early production of IL-6 in the liver is detrimental for the parasite growth, contributing to the acquisition of a long-lasting immune protection after immunization with live attenuated parasites. Considering that IL-6 ais a critical pro-inflammatory signal, we explored a novel approach whereby the parasite itself encodes for the murine IL-6 gene. We generated transgenic P. berghei parasites that express murine IL-6 during liver stage development. Though IL-6 transgenic sporozoites develop into exo-erythrocytic forms in cultured hepatocytes in vitro and in vivo , these parasites were not capable of inducing a blood stage infection in mice. Furthermore, immunization of mice with transgenic IL-6-expressing P. berghei sporozoites elicited a long-lasting CD8 + T cell-mediated protective immunity against a subsequent infectious sporozoite challenge. Collectively, this study demonstrates that parasite-encoded IL-6 attenuates parasite virulence with abortive liver stage of Plasmodium infection, forming the basis of a novel suicide vaccine strategy to elicit protective antimalarial immunity. Summary IL-6 was shown to control Plasmodium parasite development in the liver. Here, Belhimeur et al. generated a murine IL-6 transgenic Plasmodium berghei . These parasites show an arrest in hepatocyte development and protect mice against homologous and heterologous parasite challenge in a CD8-dependent manner.