Abstract Killer toxins are extracellular antifungal proteins that are produced by a wide variety of fungi, including Saccharomyces yeasts. Although many Saccharomyces killer toxins have been previously identified, their evolutionary origins remain uncertain given that many of the se genes have been mobilized by double-stranded RNA (dsRNA) viruses. A survey of yeasts from the Saccharomyces genus has identified a novel killer toxin with a unique spectrum of activity produced by Saccharomyces paradoxus . The expression of this novel killer toxin is associated with the presence of a dsRNA totivirus and a satellite dsRNA. Genetic sequencing of the satellite dsRNA confirmed that it encodes a killer toxin with homology to the canonical ionophoric K1 toxin from Saccharomyces cerevisiae and has been named K1-like (K1L). Genomic homologs of K1L were identified in six non- Saccharomyces yeast species of the Saccharomycotina subphylum, predominantly in subtelomeric regions of the yeast genome. The sporadic distribution of these genes supports their acquisition by horizontal gene transfer followed by diversification, with evidence of gene amplification and positive natural selection. When ectopically expressed in S. cerevisiae from cloned cDNAs, both K1L and its homologs can inhibit the growth of competing yeast species, confirming the discovery of a new family of biologically active killer toxins. The phylogenetic relationship between K1L and its homologs suggests gene flow via dsRNAs and DNAs across taxonomic divisions to enable the acquisition of a diverse arsenal of killer toxins for use in niche competition.

ABSTRACT Compared to other species of Candida yeasts, the growth of Candida glabrata was inhibited by many different strains of Saccharomyces killer yeasts. The ionophoric K1 and K2 killer toxins were broadly inhibitory to all clinical isolates of C. glabrata from patients with recurrent vulvovaginal candidiasis, despite high levels of resistance to clinically relevant antifungal therapeutics.

The injection of laboratory animals with pathogenic microorganisms poses a significant safety risk because of the potential for injury by accidental needlestick. This is especially true for researchers using invertebrate models of disease due to the small size of the animals and the required precision and accuracy of the injection. The immobilization of the greater wax moth larvae ( Galleria mellonella ) is often achieved by grasping a larva firmly between finger and thumb. Needle resistant gloves or forceps can be used to reduce the risk of a needlestick but can result in animal injury, a loss of throughput, and inconsistencies in experimental data. Immobilization devices are commonly used for the manipulation of small mammals, and in this manuscript, we describe the construction of injection chambers that can be used to entrap and restrain G. mellonella larvae prior to injection with pathogenic microbes. These devices significantly reduce the manual handling of larvae and provide protection against accidental needlestick injury while maintaining a high rate of injection.

Mycoviruses are widely distributed across fungi, including yeasts of the Saccharomycotina subphylum. It was recently discovered that the yeast species Pichia membranifaciens contained double stranded RNAs (dsRNAs) that were predicted to be of viral origin. The fully sequenced dsRNA is 4,578 bp in length, with RNA secondary structures similar to the packaging, replication, and frameshift signals of totiviruses of the family Totiviridae. This novel virus has been named Pichia membranifaciens virus L-A (PmV-L-A) and is related to other totiviruses previously described within the Saccharomycotina yeasts. PmV-L-A is part of a monophyletic subgroup within the I-A totiviruses, implying a common ancestry between mycoviruses isolated from the Pichiaceae and Saccharomycetaceae yeasts. Energy minimized AlphaFold2 molecular models of the PmV-L-A Gag protein revealed structural conservation with the previously solved structure of the Saccharomyces cerevisiae virus L-A (ScV-L-A) Gag protein. The predicted tertiary structure of the PmV-L-A Pol and its homologs provide details of the potential mechanism of totivirus RNA-dependent RNA polymerases (RdRps) because of structural similarities to the RdRps of mammalian dsRNA viruses. Insights into the structure, function, and evolution of totiviruses gained from yeasts is important because of their parallels with mammalian viruses and the emerging role of totiviruses in animal disease.