Abstract Inhibitors of the JAK family of nonreceptor tyrosine kinases have demonstrated clinical efficacy in rheumatoid arthritis and other inflammatory disorders; however, the precise mechanisms by which JAK inhibition improves inflammatory immune responses remain unclear. In this study, we examined the mode of action of tofacitinib (CP-690,550) on JAK/STAT signaling pathways involved in adaptive and innate immune responses. To determine the extent of inhibition of specific JAK/STAT-dependent pathways, we analyzed cytokine stimulation of mouse and human T cells in vitro. We also investigated the consequences of CP-690,550 treatment on Th cell differentiation of naive murine CD4+ T cells. CP-690,550 inhibited IL-4–dependent Th2 cell differentiation and interestingly also interfered with Th17 cell differentiation. Expression of IL-23 receptor and the Th17 cytokines IL-17A, IL-17F, and IL-22 were blocked when naive Th cells were stimulated with IL-6 and IL-23. In contrast, IL-17A production was enhanced when Th17 cells were differentiated in the presence of TGF-β. Moreover, CP-690,550 also prevented the activation of STAT1, induction of T-bet, and subsequent generation of Th1 cells. In a model of established arthritis, CP-690,550 rapidly improved disease by inhibiting the production of inflammatory mediators and suppressing STAT1-dependent genes in joint tissue. Furthermore, efficacy in this disease model correlated with the inhibition of both JAK1 and JAK3 signaling pathways. CP-690,550 also modulated innate responses to LPS in vivo through a mechanism likely involving the inhibition of STAT1 signaling. Thus, CP-690,550 may improve autoimmune diseases and prevent transplant rejection by suppressing the differentiation of pathogenic Th1 and Th17 cells as well as innate immune cell signaling.

Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) is a rare genetic disease driven by gain-of-function variants in activin receptor–like kinase 2 (ALK2), the most common variant being ALK2 R206H . In FOP, ALK2 variants display increased and dysregulated signaling through the bone morphogenetic protein (BMP) pathway resulting in progressive and permanent replacement of skeletal muscle and connective tissues with heterotopic bone, ultimately leading to severe debilitation and premature death. Here, we describe the discovery of BLU-782 (IPN60130), a small-molecule ALK2 R206H inhibitor developed for the treatment of FOP. A small-molecule library was screened in a biochemical ALK2 binding assay to identify potent ALK2 binding compounds. Iterative rounds of structure-guided drug design were used to optimize compounds for ALK2 R206H binding, ALK2 selectivity, and other desirable pharmacokinetic properties. BLU-782 preferentially bound to ALK2 R206H with high affinity, inhibiting signaling from ALK2 R206H and other rare FOP variants in cells in vitro without affecting signaling of closely related homologs ALK1, ALK3, and ALK6. In vivo efficacy of BLU-782 was demonstrated using a conditional knock-in ALK2 R206H mouse model, where prophylactic oral dosing reduced edema and prevented cartilage and heterotopic ossification (HO) in both muscle and bone injury models. BLU-782 treatment preserved the normal muscle-healing response in ALK2 R206H mice. Delayed dosing revealed a short 2-day window after injury when BLU-782 treatment prevented HO in ALK2 R206H mice, but dosing delays of 4 days or longer abrogated HO prevention. Together, these data suggest that BLU-782 may be a candidate for prevention of HO in FOP.

Abstract Background & Aims Fibrolamellar carcinoma (FLC) is a rare, difficult-to-treat liver cancer primarily affecting pediatric and adolescent patients, and for which precision medicine approaches have historically not been possible. The DNAJB1-PRKACA gene fusion was identified as a driver of FLC pathogenesis. We aimed to assess whether FLC tumors maintain dependency on this gene fusion and determine if PRKACA is a viable therapeutic target. Methods FLC patient-derived xenograft (PDX) shRNA cell lines were implanted subcutaneously into female NOD-SCID mice and tumors were allowed to develop prior to randomization to doxycycline (to induce knockdown) or control groups. Tumor development was assessed every 2 days. To assess the effect of treatment with novel selective PRKACA small molecule kinase inhibitors, BLU0588 and BLU2864, FLC PDX tumor cells were implanted subcutaneously into NOD-SCID mice and tumors allowed to develop. Mice were randomized to treatment (BLU0588 and BLU2864, orally, once daily) or control groups and tumor size determined as above. Results Knockdown of DNAJB1-PRKACA reversed a FLC-specific gene signature and reduced PDX tumor growth in mice compared to the control group. Furthermore, FLC PDX tumor growth was significantly reduced with BLU0588 and BLU2864 treatment versus control ( P = 0.003 and P = 0.0005, respectively). Conclusions We demonstrated, using an inducible knockdown and small molecule approaches, that FLC PDX tumors were dependent upon DNAJB1 - PRKACA fusion activity. In addition, this study serves as a proof-of-concept that PRKACA is a viable therapeutic target for FLC and warrants further investigation.