Several vertebrate microRNAs (miRNAs) have been implicated in cellular processes such as muscle differentiation, synapse function, and insulin secretion. In addition, analysis of Dicer null mutants has shown that miRNAs play a role in tissue morphogenesis. Nonetheless, only a few loss-of-function phenotypes for individual miRNAs have been described to date. Here, we introduce a quick and versatile method to interfere with miRNA function during zebrafish embryonic development. Morpholino oligonucleotides targeting the mature miRNA or the miRNA precursor specifically and temporally knock down miRNAs. Morpholinos can block processing of the primary miRNA (pri-miRNA) or the pre-miRNA, and they can inhibit the activity of the mature miRNA. We used this strategy to knock down 13 miRNAs conserved between zebrafish and mammals. For most miRNAs, this does not result in visible defects, but knockdown of miR-375 causes defects in the morphology of the pancreatic islet. Although the islet is still intact at 24 hours postfertilization, in later stages the islet cells become scattered. This phenotype can be recapitulated by independent control morpholinos targeting other sequences in the miR-375 precursor, excluding off-target effects as cause of the phenotype. The aberrant formation of the endocrine pancreas, caused by miR-375 knockdown, is one of the first loss-of-function phenotypes for an individual miRNA in vertebrate development. The miRNA knockdown strategy presented here will be widely used to unravel miRNA function in zebrafish.

ABSTRACT Objectives Thrombotic and microvascular complications are frequently seen in deceased COVID-19 patients. However, whether this is caused by direct viral infection of the endothelium or inflammation-induced endothelial activation remains highly contentious. Methods Here, we use patient autopsy samples, primary human endothelial cells and an in vitro model of the pulmonary epithelial-endothelial cell barrier to show that primary human endothelial cells express very low levels the SARS-CoV-2 receptor ACE2 and the protease TMPRSS2. Results Accordingly, endothelial cells can only be infected when SARS-CoV-2 is present at very high concentrations. However, this is not a productive infection (i.e. no infectious virus is produced) and viral entry induces an inflammatory response. We also show that SARS-CoV-2 does not infect endothelial cells in 3D vessels under flow conditions. We further demonstrate that in a co-culture model endothelial cells are not infected with SARS-CoV-2. They do however sense and respond to infection in the adjacent epithelial cells, increasing ICAM-1 expression and releasing pro-inflammatory cytokines. Conclusions Taken together, these data suggest that in vivo , endothelial cells are unlikely to be infected with SARS-CoV-2 and that infection is only likely to occur if the adjacent pulmonary epithelium is denuded (basolateral infection) or a high viral load is present in the blood (apical infection). In such a scenario, whilst SARS-CoV-2 infection of the endothelium can occur, it does not contribute to viral amplification. However, endothelial cells are still likely to play a key role in SARS-CoV-2 pathogenesis by sensing adjacent infection and mounting a pro-inflammatory response to SARS-CoV-2.

During development, the lymphatic vasculature forms as a second, new vascular network derived from blood vessels. The transdifferentiation of embryonic venous endothelial cells (VECs) into lymphatic endothelial cells (LECs) is the first step in this process. Specification, differentiation and maintenance of LEC fate are all driven by the transcription factor Prox1, yet downstream mechanisms remain to be elucidated. We present a single cell transcriptomic atlas of lymphangiogenesis in zebrafish revealing new markers and hallmarks of LEC differentiation over four developmental stages. We further profile single cell transcriptomic and chromatin accessibility changes in zygotic prox1a mutants that are undergoing a VEC-LEC fate reversion during differentiation. Using maternal and zygotic prox1a/prox1b mutants, we determine the earliest transcriptomic changes directed by Prox1 during LEC specification. This work altogether reveals new transcriptional targets and regulatory regions of the genome downstream of Prox1 in LEC maintenance, as well as showing that Prox1 specifies LEC fate primarily by limiting blood vascular and hematopoietic fate. This extensive single cell resource provides new mechanistic insights into the enigmatic role of Prox1 and the control of LEC differentiation in development.

Abstract Macrophages are key cellular contributors to COVID-19 pathogenesis. Whether SARS-CoV-2 can enter macrophages, replicate and release new viral progeny remains controversial. Similarly, whether macrophages need to sense replicating virus to drive cytokine release is also unclear. Macrophages are heterogeneous cells poised to respond to their local microenvironment, and accordingly, the SARS-CoV-2 entry receptor ACE2 is only present on a subset of macrophages at sites of human infection. Here, we use in vitro approaches to investigate how SARS-CoV-2 interacts with ACE2-negative and ACE2-positive human macrophages and determine how these macrophage populations sense and respond to SARS-CoV-2. We show that SARS-CoV-2 does not replicate within ACE2-negative human macrophages and does not induce pro-inflammatory cytokine expression. By contrast, ACE2 expression in human macrophages permits SARS-CoV-2 entry, replication, and virion release. ACE2-expressing macrophages sense replicating virus to trigger pro-inflammatory and anti-viral programs that limit virus release. These combined findings resolve several controversies regarding macrophage-SARS-CoV-2 interactions and identify a signaling circuit by which macrophages sense SARS-CoV-2 cell entry and respond by restricting viral replication. One sentence summary Lack of macrophage ACE2 expression precludes SARS-CoV-2 entry and sensing, while ACE2-expressing macrophages sense intramacrophage SARS-CoV-2 replication to induce rapid anti-viral responses that limit new virion release.

ABSTRACT The assembly of a mature vascular network involves the coordinated control of cell shape changes to regulate morphogenesis of a complex vascular network. Cellular changes include a process of endothelial cell (EC) elongation which is essential for establishing appropriately sized lumens during vessel maturation 1-3 . However how EC elongation is dynamically regulated in vivo is not fully understood since live monitoring of this event can be challenging in animal models. Here, we utilise the live imaging capacity of the zebrafish to explore how integrin adhesion complexes, known as Focal Adhesions (FAs), control EC dynamics in live flow pressured vasculature. To do this, we generated a zebrafish mutant, deficient for the integrin adaptor protein Talin1. Notably, unlike the severe cardiovascular defects that arise in Talin1 knockout mice 4 , vasculogenesis still occurs normally talin1 mutants and cardiac output remains sufficient up to two days post fertilisation (dpf). This allowed us to uncouple primary roles for FAs in ECs during subsequent morphogenesis events, including angiogenesis and vessel remodelling, without interference of secondary effects that might occur due to systemic vessel failure or loss of blood flow. We further established a FA marker line, expressing endothelial Vinculin-eGFP, and demonstrated that FAs are lost in our talin1 mutants. This Vinculin transgene represents the first in vivo model to monitor endothelial FA dynamics. Loss of FAs in talin1 mutants, leads to compromised F-actin rearrangements, which perturb EC elongation and cell-cell junction linearisation during vessel remodelling. Chemical induction of actin polymerisation can restore these cellular phenotypes, suggesting a recovery of actin rearrangements that are sufficient to allow cell and junction shape changes. Together, we have identified that FAs are essential for active guidance of EC elongation and junction linearisation in flow pressured vessels. These observations can explain the severely compromised vessel beds, haemorrhage and vascular leakage that has been observed in mouse models that lack integrin signalling 4-8 .

Abstract Lymphatic vascular development is regulated by well-characterised signalling and transcriptional pathways. These pathways regulate lymphatic endothelial cell (LEC) migration, motility, polarity and and morphogenesis. Canonical and non-canonical WNT signalling pathways are known to control LEC polarity and development of lymphatic vessels and valves. PKD1 , encoding Polycystin-1, is the most commonly mutated gene in polycystic kidney disease but has also been shown to be essential in lymphatic vascular morphogenesis. The mechanism by which Pkd1 acts during lymphangiogenesis remains unclear. Here we find that loss of non-canonical WNT signalling components Wnt5a and Ryk phenocopy lymphatic defects seen in Pkd1 knockout mice. To investigate genetic interaction, we generated Pkd1 / Wnt5a double knockout mice. Loss of Wnt5a suppressed phenotypes seen in the lymphatic vasculature of Pkd1 −/− mice and Pkd1 deletion suppressed phenotypes observed in Wnt5a −/− mice. Thus, we report mutually suppressive roles for Pkd1 and Wnt5a, with developing lymphatic networks restored to a more wild-type state in double mutant mice. This genetic interaction between Pkd1 and the non-canonical WNT signalling pathway ultimately controls LEC polarity and the morphogenesis of developing vessel networks. Our work suggests that Pkd1 acts at least in part by regulating non-canonical WNT signalling during the formation of lymphatic vascular networks.

Endothelial cells lining the blood vessel wall communicate intricately with the surrounding extracellular matrix, translating mechanical cues into biochemical signals. Moreover, vessels require the capability to enzymatically degrade the matrix surrounding them, to facilitate vascular expansion. c-Src plays a key role in blood vessel growth, with its loss in the endothelium reducing vessel sprouting and focal adhesion signalling. Here, we show that constitutive activation of c-Src in endothelial cells results in rapid vascular expansion, operating independently of growth factor stimulation or fluid shear stress forces. This is driven by an increase in focal adhesion signalling and size, with enhancement of localised secretion of matrix metalloproteinases responsible for extracellular matrix remodelling. Inhibition of matrix metalloproteinase activity results in a robust rescue of the vascular expansion elicited by heightened c-Src activity. This supports the premise that moderating focal adhesion-related events and matrix degradation can counteract abnormal vascular expansion, with implications for pathologies driven by unusual vascular morphologies.

ABSTRACT Cerebral Cavernous Malformations (CCMs) are vascular lesions that predominantly form in blood vessels of the central nervous system (CNS) upon loss of the CCM multimeric protein complex. The endothelial cells (ECs) within CCM lesions are characterised by overactive MEKK3 kinase and KLF2/4 transcription factor signalling, leading to pathological changes such as increased EC spreading and reduced junctional integrity. Concomitant to aberrant EC signalling, non-autonomous signals from the extracellular matrix (ECM) have also been implicated in CCM lesion growth and these factors might explain why CCM lesions mainly develop in the CNS. Here, we adapted a three dimensional (3D) microfluidic system to examine CCM1 deficient human micro-vessels in distinctive ECMs. We validate that EC pathological hallmarks are maintained in this 3D model. We further show that key genes responsible for homeostasis of Hyaluronic Acid (HA), a major ECM component of the CNS, are dysregulated in CCM. Supplementing the ECM in our model with forms of HA that are predicted to be reduced, inhibits CCM cellular phenotypes, independent of KLF2/4. This study thereby provides a proof-of-principle that ECM embedded 3D microfluidic models are ideally suited to identify how changes in ECM structure and signalling impact vascular malformations.

Endothelial cells lining the blood vessel wall communicate intricately with the surrounding extracellular matrix, translating mechanical cues into biochemical signals. Moreover, vessels require the capability to enzymatically degrade the matrix surrounding them, to facilitate vascular expansion. c-Src plays a key role in blood vessel growth, with its loss in the endothelium reducing vessel sprouting and focal adhesion signalling. Here, we show that constitutive activation of c-Src in endothelial cells results in rapid vascular expansion, operating independently of growth factor stimulation or fluid shear stress forces. This is driven by an increase in focal adhesion signalling and size, with enhancement of localised secretion of matrix metalloproteinases responsible for extracellular matrix remodelling. Inhibition of matrix metalloproteinase activity results in a robust rescue of the vascular expansion elicited by heightened c-Src activity. This supports the premise that moderating focal adhesion-related events and matrix degradation can counteract abnormal vascular expansion, with implications for pathologies driven by unusual vascular morphologies.

Angiogenesis and vascular remodeling are driven by a wide range of endothelial cell behaviors, such as cell divisions, cell movements, cell shape and polarity changes. To decipher the cellular and molecular mechanism of cell movements, we have analyzed the dynamics of different junctional components during blood vessel anastomosis in vivo. We show that endothelial cell movements are associated with oscillating lamellipodia-like structures, which are orientated in the direction of these movements. These structures emerge from endothelial cell junctions and we thus call them junction-based lamellipodia (JBL). High-resolution time-lapse imaging shows that JBL are formed by F-actin based protrusions at the front end of moving cells. These protrusions also contain diffusely distributed VE-cadherin, whereas the junctional protein ZO-1 (Zona occludens 1) remains at the junction. Subsequently, a new junction is formed at the front of the JBL and the proximal junction is pulled towards the newly established distal junction. JBL function is highly dependent on F-actin dynamics. Inhibition of F-actin polymerization prevents JBL formation, whereas Rac-1 inhibition interferes with JBL oscillations. Both interventions disrupt endothelial junction formation and cell elongation. To examine the role of VE-cadherin (encoded by cdh5 gene) in this process, we generated a targeted mutation in VE-cadherin gene (cdh5ubs25), which prevents VE-cad/F-actin interaction. Although homozygous ve-cadherin mutants form JBL, these JBL are less dynamic and do not promote endothelial cell elongation. Taken together, our observations suggest a novel oscillating ratchet-like mechanism, which is used by endothelial cells to move along or over each other and thus provides the physical means for cell rearrangements.