The COVID-19 pandemic is caused by severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2 (SARS-CoV-2). The betacoronvirus has a positive sense RNA genome which encodes for several RNA binding proteins. Here, we use enhanced crosslinking and immunoprecipitation to investigate SARS-CoV-2 protein interactions with viral and host RNAs in authentic virus-infected cells. SARS-CoV-2 proteins, NSP8, NSP12, and nucleocapsid display distinct preferences to specific regions in the RNA viral genome, providing evidence for their shared and separate roles in replication, transcription, and viral packaging. SARS-CoV-2 proteins expressed in human lung epithelial cells bind to 4773 unique host coding RNAs. Nine SARS-CoV-2 proteins upregulate target gene expression, including NSP12 and ORF9c, whose RNA substrates are associated with pathways in protein N-linked glycosylation ER processing and mitochondrial processes. Furthermore, siRNA knockdown of host genes targeted by viral proteins in human lung organoid cells identify potential antiviral host targets across different SARS-CoV-2 variants. Conversely, NSP9 inhibits host gene expression by blocking mRNA export and dampens cytokine productions, including interleukin-1α/β. Our viral protein-RNA interactome provides a catalog of potential therapeutic targets and offers insight into the etiology of COVID-19 as a safeguard against future pandemics.

Abstract Biosensors are key components in engineered biological systems, providing a means of measuring and acting upon the large biochemical space in living cells. However, generating small molecule sensing elements and integrating them into in vivo biosensors have been challenging. Using aptamer-coupled ribozyme libraries and a novel ribozyme regeneration method, we developed de novo rapid in vitro evolution of RNA biosensors (DRIVER) that enables multiplexed discovery of biosensors. With DRIVER and high-throughput characterization (CleaveSeq) fully automated on liquid-handling systems, we identified and validated biosensors against six small molecules, including five for which no aptamers were previously found. DRIVER-evolved biosensors were applied directly to regulate gene expression in yeast, displaying activation ratios up to 33-fold. DRIVER biosensors were also applied in detecting metabolite production from a multi-enzyme biosynthetic pathway. This work demonstrates DRIVER as a scalable pipeline for engineering de novo biosensors with wide-ranging applications in biomanufacturing, diagnostics, therapeutics, and synthetic biology.

Abstract RNA-binding proteins (RBPs) control RNA metabolism to orchestrate gene expression, and dysfunctional RBPs underlie many human diseases. Proteome-wide discovery efforts predict thousands of novel RBPs, many of which lack canonical RNA-binding domains. Here, we present a hybrid ensemble RBP classifier (HydRA) that leverages information from both intermolecular protein interactions and internal protein sequence patterns to predict RNA-binding capacity with unparalleled specificity and sensitivity using support vector machine, convolutional neural networks and transformer-based protein language models. HydRA enables Occlusion Mapping to robustly detect known RNA-binding domains and to predict hundreds of uncharacterized RNA-binding domains. Enhanced CLIP validation for a diverse collection of RBP candidates reveals genome-wide targets and confirms RNA-binding activity for HydRA-predicted domains. The HydRA computational framework accelerates construction of a comprehensive RBP catalogue and expands the set of known RNA-binding protein domains. Highlights HydRA combines protein-protein interaction and amino acid sequence information to predict RNA binding activity for 1,487 candidate genes. HydRA predicts RNA binding with higher specificity and sensitivity than current approaches, notably for RBPs without well-defined RNA-binding domains. Occlusion Mapping with HydRA enables RNA-binding domain discovery. Enhanced CLIP confirms HydRA RBP predictions with RNA-binding domain resolution.