Abstract The pathogenesis of lung hypoplasia in congenital diaphragmatic hernia (CDH), a common birth defect, is poorly understood. The diaphragmatic defect can be repaired surgically, but the abnormal lung development contributes to a high mortality in these patients. To better understand the underlying pathobiology, we used the nitrofen rat model of CDH and characterized the proteome of hypoplastic CDH lungs at the alveolar stage (E21). Amongst the 218 significantly altered proteins between CDH and control lungs were Tenascin C, CREBBP, LYN and STAT3. We showed that Tenascin C was decreased around the distal airway branches in nitrofen and human fetal CDH lungs. In contrast, STAT3 was significantly increased in the airway epithelium of nitrofen lungs at E21. STAT3 inhibition after direct nitrofen exposure to fetal rat lung explants (E14.5) partially reversed the hypoplastic lung phenotype ex vivo by increasing peripheral lung budding. Moreover, we demonstrated that several STAT3 associated cytokines (IL-15, IL-9, IL-2) are increased in fetal tracheal aspirates of CDH survivors compared to non-survivors after fetoscopic tracheal occlusion. Using pathway analysis for significantly altered proteins in our proteomic analysis, we observed an enrichment in inflammatory response associated with Epstein Barr Virus and cytokine signaling in nitrofen CDH lungs. However, we were unable to detect EBV mRNA via in-situ Hybridization in human CDH lungs. With our unbiased proteomics approach, we show for the first time that inflammatory processes are likely underlying the pathogenesis of abnormal lung development in CDH.

Abstract Background & Objective Abnormal lung development is the main cause of morbidity and mortality in neonates with congenital diaphragmatic hernia (CDH), a common birth defect (1:2500) of largely unknown pathobiology. Recent studies discovered that inflammatory processes, and specifically NF-κB associated pathways are enriched in human and experimental CDH. However, the molecular signaling of NF-κB in abnormal CDH lung development and its potential as a therapeutic target requires further investigation. Methods & Results Using sections and hypoplastic lung explant cultures from the nitrofen rat model of CDH and human fetal CDH lungs, we demonstrate that NF-κB and its downstream transcriptional targets are hyperactive during abnormal lung formation in CDH. NF-κB activity was especially elevated in the airway epithelium of nitrofen and human CDH lungs at different developmental stages. Fetal rat lung explants had impaired pseudoglandular airway branching after exposure to nitrofen, together with increased phosphorylation and transcriptional activity of NF-κB. Dexamethasone, the broad and clinically applicable anti-inflammatory NF-κB antagonist, rescued lung branching and normalized NF-κB signaling in hypoplastic lung explants. Moreover, specific NF-κB inhibition with curcumenol similarly rescued ex vivo lung hypoplasia and restored NF-κB signaling. Lastly, we showed that prenatal intraperitoneal dexamethasone administration to pregnant rat dams carrying fetuses with hypoplastic lungs, significantly improves lung branching and normalizes NF-κB in vivo . Conclusions: Our results indicate that NF-κB is aberrantly activated in human and nitrofen CDH lungs. Anti-inflammatory treatment with dexamethasone and/ or specific NF-κB inhibition should be investigated further as a therapeutic avenue to target lung hypoplasia in CDH.