Abstract Brain anatomy is highly variable and it is widely accepted that anatomical variation impacts brain function and ultimately behavior. The structural complexity of the brain, including differences in volume and shape, presents an enormous barrier to define how variability underlies differences in function. In this study, we sought to investigate the evolution of brain anatomy in relation to brain region volume and shape across the brain of a single species with variable genetic and anatomical morphs. We generated a high-resolution brain atlas for the blind Mexican cavefish and coupled the atlas with automated computational tools to directly assess brain region shape and volume variability across all populations. We measured the volume and shape of every neuroanatomical region of the brain and assess correlations between anatomical regions in surface, cavefish and surface to cave F 2 hybrids, whose phenotypes span the range of surface to cave. We find that dorsal regions of the brain are contracted in cavefish, while ventral regions have expanded. Interestingly, in hybrid fish the volume and shape of dorsal regions are inversely proportional to ventral regions. This trend is true for both volume and shape, suggesting that these two parameters share developmental mechanisms necessary for remodeling the entire brain. Given the high conservation of brain anatomy and function among vertebrate species, we expect these data to studies reveal generalized principles of brain evolution and show that Astyanax provides a system for functionally determining basic principles of brain evolution by utilizing the independent genetic diversity of different morphs, to test how genes influence early patterning events to drive brain-wide anatomical evolution.

Abstract Animals display remarkable diversity in rest and activity patterns that are regulated by endogenous foraging strategies, social behaviors, and predator avoidance. Alteration in the circadian timing of activity or the duration of rest-wake cycles provide a central mechanism for animals to exploit novel niches. The diversity of the 3000+ cichlid species throughout the world provides a unique opportunity to examine variation in locomotor activity and rest. Lake Malawi alone is home to over 500 species of cichlids that display divergent behaviors and inhabit well-defined niches throughout the lake. These species are presumed to be diurnal, though this has never been tested systematically. Here, we measure locomotor activity across the circadian cycle in 12 cichlid species from divergent lineages and distinct habitats. We document surprising variability in the circadian time of locomotor activity and the duration of rest. In particular, we identify a single species, Tropheops sp. “red cheek” that is nocturnal. Nocturnal behavior was maintained when fish were provided shelter, but not under constant darkness, suggesting it results from acute response to light rather than an endogenous circadian rhythm. Finally, we show that nocturnality is associated with increased eye size, suggesting a link between visual processing and nighttime activity. Together, these findings identify diversity of locomotor behavior in Lake Malawi cichlids and provide a system for investigating the molecular and neural basis underlying the evolution of nocturnal activity.

Abstract Activity patterns tend to be highly stereotyped and critical for executing many different behaviors including foraging, social interactions and predator avoidance. Differences in the circadian timing of locomotor activity and rest periods can facilitate habitat partitioning and the exploitation of novel niches. As a consequence, closely related species often display highly divergent activity patterns, raising the possibility that a shift from diurnal to nocturnal behavior, or vice versa, can occur rapidly. In Africa’s Lake Malawi alone, there are over 500 species of cichlids, which inhabit diverse environments and exhibit extensive phenotypic variation. We have previously identified a substantial range in activity patterns across adult Lake Malawi cichlid species, from strongly diurnal to strongly nocturnal. In many species, including fishes, ecological pressures differ dramatically across life-history stages, raising the possibility that activity patterns may change over ontogeny. To determine if rest-activity patterns change across life stages we compared the locomotor patterns of six Lake Malawi cichlid species. While total rest and activity did not change between early juvenile and adult stages, rest-activity patterns did, with juveniles displaying distinct activity rhythms that are more robust than adults. One distinct difference between juveniles and adults is the emergence of complex social behavior. To determine whether social context is required for activity rhythms, we next measured locomotor behavior in group housed adult fish. We found that when normal social interactions were allowed, locomotor activity patterns were restored, supporting the notion that social interactions promote circadian regulation of activity in adult fish. These findings reveal a previously unidentified link between developmental stage and social interactions in the circadian timing of cichlid activity.

Abstract Astyanax mexicanus is a freshwater fish species with blind cave morphs and sighted surface morphs. Like other troglodytic species, independently evolved cave-dwelling A. mexicanus populations share several stereotypic phenotypes, including the expansion of certain sensory systems, as well as the loss of eyes and pigmentation. Here we assess the extent to which there is also parallelism in craniofacial development across cave populations. Since multiple forces may be acting upon variation in the A. mexicanus system, including phylogenetic history, selection and developmental constraint, several outcomes are possible. For example, eye regression may have triggered a conserved series of compensatory developmental events, in which case we would expect to observe highly similar craniofacial phenotypes across cave populations. Selection for cave-specific foraging may also lead to the evolution of a conserved craniofacial phenotype, especially in regions of the head directly associated with feeding. Alternatively, in the absence of a common axis of selection or strong developmental constraints, craniofacial shape may evolve under neutral processes such as gene flow, drift, and bottlenecking, in which case patterns of variation should reflect the evolutionary history of A. mexicanus. Our results found that cave-adapted populations do share certain anatomical features; however, they generally did not support the hypothesis of a conserved craniofacial phenotype across caves, as nearly every pairwise comparison was statistically significant, with greater effect-sizes noted between more distantly related cave populations with little gene flow. A similar pattern was observed for developmental trajectories. We also found that morphological disparity was lower amongst all three cave populations versus surface fish, suggesting eye loss is not associated with increased variation, which would be consistent with a release of developmental constraint. Instead, this pattern reflects the relatively low genetic diversity within cave populations. Finally, magnitudes of craniofacial integration were found to be similar among all groups, meaning that coordinated development among anatomical units is robust to eye loss in A. mexicanus. We conclude that in contrast to many conserved phenotypes across cave populations, global craniofacial shape is more variable, and patterns of shape variation are more in line with population structure than developmental architecture or selection.

Studying instances of convergent evolution of novel phenotypes can shed light on the evolutionary constraints that shape morphological diversity. Cichlid fishes from the East African Great Lakes are a prime model to investigate convergent adaptations. However, most studies on cichlid craniofacial morphologies have primarily considered bony structures, while soft tissue adaptations have been less intensely scrutinised. A rare example of an exaggerated soft tissue phenotype is the formation of a snout flap. This tissue flap develops from the upper lip and has evolved in only one cichlid genus from Lake Malawi and one genus from Lake Tanganyika. To investigate the molecular basis of snout flap convergence, we used mRNA sequencing to compare two species with snout flap (Labeotropheus trewavasae and Ophthalmotilapia nasuta) to their close relatives without snout flaps (Tropheops tropheops and Ophthalmotilapia ventralis) from Lake Tanganyika and Malawi. Our analysis revealed a greater complexity of differential gene expression patterns underlying the snout flap in the younger adaptive radiation of Lake Malawi than in the older Lake Tanganyika radiation. We identified 201 genes that were repeatedly differentially expressed between species with and without the snout flap in both lakes, suggesting that the pathway that gives rise to snout flaps is evolutionarily constrained, even though the flaps play very different functions in each species. The convergently expressed genes are involved in proline and hydroxyproline metabolism, which have been linked to human skin and facial deformities. Additionally, we also found enrichment for transcription factor binding sites upstream of differentially expressed genes such as members of the FOX transcription factor family, especially foxf1 and foxa2, which also showed an increased expression in the flapped snout and are linked to nose morphogenesis in mammals, as well as ap4 (tfap4), a transcription factor showing reduced expression in the flapped snout with an unknown role in the development of craniofacial soft tissues. As genes involved in cichlids snout flap development are associated with many human mid-line facial dysmorphologies, our findings imply a conservation of genes involved in mid-line patterning across vastly distant evolutionary lineages of vertebrates.

For many vertebrates, a single genetic locus initiates a cascade of developmental sex differences in the gonad and throughout the organism, resulting in adults with two, phenotypically distinct sexes. Species with polygenic sex determination (PSD) have multiple interacting sex determination alleles segregating within a single species, allowing for more than two genotypic sexes, and scenarios where sex genotype at a given locus can be decoupled from gonadal sex. Here we investigate the effects of PSD on secondary sexual characteristics in the cichlid fish Metriaclima mbenjii , where one female (W) and one male (Y) sex determination allele interact to produce siblings with four possible sex classes: ZZXX females, ZWXX females, ZWXY females, and ZZXY males. We find that PSD in M. mbenjii produces an interplay of sex-linkage and sex-limitation resulting in modular variation in morphological and behavioral traits. Further, the evolution or introgression of a novel sex determiner creates additional axes of phenotypic variation for varied traits, including genital morphology, craniofacial morphology, gastrointestinal morphology, and home tank behaviors. In contrast to single-locus sex determination, which broadly results in sexual dimorphism, polygenic sex determination can induce higher-order sexual polymorphism. The modularity of secondary sexual characteristics produced by PSD provides novel context for understanding the evolutionary causes and consequences of maintenance, gain, or loss of sex determination alleles in populations. Significance Statement Sex differences in traits can occur when those traits are modified by genetic factors inherited on sex chromosomes. We investigated how sex differences emerge in a species with more than one set of sex chromosomes, measuring a variety of morphological, physiological, and behavioral traits. Rather than exhibiting sexual dimorphism associated with primary sex, the species has higher-order sexual polymorphism in secondary sexual characteristics, or more than two phenotypic sexes. Variation in secondary sexual characteristics is modular, involving the interplay of sex-linked and sex-limited traits. Our findings provide novel implications for how sex determination systems and whole-organism fitness traits co-evolve, including that significant creation or loss of variation in diverse traits can occur during transitions among sex chromosome systems.