Abstract Antibiotics are a cornerstone of medicine, placing bacterial pathogens under intense pressure to evolve new survival mechanisms. Analysis of 51,229 Mycobacterium tuberculosis (Mtb) clinical isolates identified an essential transcriptional regulator, Rv1830 ( here named resR) as a frequent target of positive (adaptive) selection. resR mutants do not demonstrate canonical drug resistance or drug tolerance but instead have significantly faster recovery after drug treatment across all antibiotics and combinations tested, a phenotype which we term antibiotic resilience. ResR acts in a regulatory cascade with other growth-controlling transcriptional regulators WhiB2 and WhiA, which are also under positive selection in Mtb clinical isolates. Mutations of these genes are associated with treatment failure and the acquisition of canonical drug resistance.

Abstract Transcriptional regulation is a critical adaptive mechanism that allows bacteria to respond to changing environments, yet the concept of transcriptional plasticity (TP) remains largely unexplored. In this study, we investigate the genome-wide TP profiles of Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) genes by analyzing 894 RNA sequencing samples derived from 73 different environmental conditions. Our data reveal that Mtb genes exhibit significant TP variation that correlates with gene function and gene essentiality. We also found that critical genetic features, such as gene length, GC content, and operon size independently impose constraints on TP, beyond trans-regulation. By extending our analysis to include two other Mycobacterium species -- M. smegmatis and M. abscessu s -- we demonstrate a striking conservation of the TP landscape. This study provides a comprehensive understanding of the TP exhibited by mycobacteria genes, shedding light on this significant, yet understudied, genetic feature encoded in bacterial genomes.

Toxin-antitoxin (TA) systems are ubiquitous genetic elements in bacterial genomes, but their functions are controversial. Although they are frequently postulated to regulate cell growth following stress, few null phenotypes for TA systems have been reported. Here, we show that TA transcript levels can increase substantially in response to stress, but toxin is not liberated. We find that the growth of an Escherichia coli strain lacking 10 TA systems encoding endoribonuclease toxins is not affected following exposure to six stresses that each trigger TA transcription. Additionally, using RNA-sequencing, we find no evidence of mRNA cleavage following stress. Stress-induced transcription arises from antitoxin degradation and relief of transcriptional autoregulation. Importantly, although free antitoxin is readily degraded in vivo, antitoxin bound to toxin is protected from proteolysis, preventing release of active toxin. Thus, transcription is not a reliable marker of TA activity, and TA systems likely do not strongly promote survival following stress.

The profiling of gene expression by RNA-sequencing (RNA-seq) has enabled powerful studies of global transcriptional patterns in all organisms, including bacteria. Because the vast majority of RNA in bacteria is ribosomal RNA (rRNA), it is standard practice to deplete the rRNA from a total RNA sample such that the reads in an RNA-seq experiment derive predominantly from mRNA. One of the most commonly used commercial kits for rRNA depletion, the Ribo-Zero kit from Illumina, was recently discontinued. Here, we report the development a simple, cost- effective, and robust method for depleting rRNA that can be easily implemented by any lab or facility. We first developed an algorithm for designing biotinylated oligonucleotides that will hybridize tightly and specifically to the 23S, 16S, and 5S rRNAs from any species of interest. Precipitation of these oligonucleotides bound to rRNA by magnetic streptavidin beads then depletes rRNA from a complex, total RNA sample such that ~75-80% of reads in a typical RNA- seq experiment derive from mRNA. Importantly, we demonstrate a high correlation of RNA abundance or fold-change measurements in RNA-seq experiments between our method and the previously available Ribo-Zero kit. Complete details on the methodology are provided, including open-source software for designing oligonucleotides optimized for any bacterial species or metagenomic sample of interest.

Abstract Toxin-antitoxin systems are widely distributed genetic modules typically featuring toxins that can inhibit bacterial growth and antitoxins that can reverse inhibition. Although Escherichia coli encodes 11 toxins with known or putative endoribonuclease activity, the target of most of these toxins remain poorly characterized. Using a new RNA-seq pipeline that enables the mapping and quantification of RNA cleavage with single-nucleotide resolution, we characterize the targets and specificities of 9 endoribonuclease toxins from E. coli . We find that these toxins use low-information cleavage motifs to cut a significant proportion of mRNAs in E. coli , but not tRNAs or the rRNAs from mature ribosomes. However, all the toxins, including those that are ribosome-dependent and cleave only translated RNA, inhibit ribosome biogenesis. This inhibition likely results from the cleavage of ribosomal protein transcripts, which disrupts the stoichiometry and biogenesis of new ribosomes and causes the accumulation of aberrant ribosome precursors. Collectively, our results provide a comprehensive, global analysis of endoribonuclease-based toxin-antitoxin systems in E. coli and support the conclusion that, despite their diversity, each disrupts translation and ribosome biogenesis. Importance Toxin-antitoxin systems are widespread genetic modules found in almost all bacteria that can regulate their growth and may play prominent roles in phage defense. Escherichia coli encodes 11 TA systems in which the toxin is a known or predicted endoribonuclease. The targets and cleavage specificities of these endoribonucleases have remained largely uncharacerized, precluding an understanding of how each impacts cell growth and an assessment of whether they have distinct or overlapping targets. Using a new and broadly applicable RNA-seq pipeline, we present a global analysis of 9 endoribonulease toxins from E. coli . We find that each uses a relatively low-information cleavage motif to cut a large proportion of mRNAs in E. coli , but not tRNAs or mature rRNAs. Notably, although the precise set of targets varies, each toxin efficiently disrupts ribosome biogenesis, primarily by cleaving the mRNAs of ribosomal proteins. In sum, the analyses presented provide new, comprehensive insights into the cleavage specificities and targets of almost all endoribonuclease toxins in E. coli . Despite different specificities, our work reveals a striking commonality in function as each toxin disrupts ribosome biogenesis and translation.