Recovery of hair cells was studied at various times after acoustic trauma in adult quail. An initial loss of hair cells recovered to within 5 percent of the original number of cells. Tritium-labeled thymidine was injected after this acoustic trauma to determine if mitosis played a role in recovery of hair cells. Within 10 days of acoustic trauma, incorporation of [ 3 H]thymidine was seen over the nuclei of hair cells and supporting cells in the region of initial hair cell loss. Thus, hair cell regeneration can occur after embryonic terminal mitosis.

Mechanoreceptive hair cells are extremely sensitive to aminoglycoside antibiotics, including neomycin. Hair cell survival was assessed in larval wild-type zebrafish lateral line neuromasts 4 h after initial exposure to a range of neomycin concentrations for 1 h. Each of the lateral line neuromasts was scored in live fish for the presence or absence of hair cells using the fluorescent vital dye DASPEI to selectively label hair cells. All neuromasts were devoid of DASPEI-labeled hair cells 4 h after 500 µM neomycin exposure. Vital DASPEI staining was proportional to the number of hair cells per neuromast identified in fixed larvae using immunocytochemistry for acetylated tubulin and phalloidin labeling. The time course of hair cell regeneration in the lateral line neuromasts was also analyzed following neomycin-induced damage. Regenerated hair cells were first observed using live DASPEI staining 12 and 24 h following neomycin treatment. The potential role of proliferation in regenerating hair cells was analyzed. A 1 h pulse-fix protocol using bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation was used to identify S-phase cells in neuromasts. BrdU incorporation in neomycin-damaged neuromasts did not differ from control neuromasts 4 h after drug exposure but was dramatically upregulated after 12 h. The proliferative cells identified during a 1 h period at 12 h after neomycin treatment were able to give rise to new hair cells by 24–48 h after drug treatment. The results presented here provide a standardized preparation for studying and identifying genes that influence vertebrate hair cell death, survival, and regeneration following ototoxic insults.

ABSTRACT BigNeuron is an open community bench-testing platform combining the expertise of neuroscientists and computer scientists toward the goal of setting open standards for accurate and fast automatic neuron reconstruction. The project gathered a diverse set of image volumes across several species representative of the data obtained in most neuroscience laboratories interested in neuron reconstruction. Here we report generated gold standard manual annotations for a selected subset of the available imaging datasets and quantified reconstruction quality for 35 automatic reconstruction algorithms. Together with image quality features, the data were pooled in an interactive web application that allows users and developers to perform principal component analysis, t -distributed stochastic neighbor embedding, correlation and clustering, visualization of imaging and reconstruction data, and benchmarking of automatic reconstruction algorithms in user-defined data subsets. Our results show that image quality metrics explain most of the variance in the data, followed by neuromorphological features related to neuron size. By benchmarking automatic reconstruction algorithms, we observed that diverse algorithms can provide complementary information toward obtaining accurate results and developed a novel algorithm to iteratively combine methods and generate consensus reconstructions. The consensus trees obtained provide estimates of the neuron structure ground truth that typically outperform single algorithms. Finally, to aid users in predicting the most accurate automatic reconstruction results without manual annotations for comparison, we used support vector machine regression to predict reconstruction quality given an image volume and a set of automatic reconstructions.

Mechanosensory hair cells of the inner ears and lateral line of vertebrates display heightened vulnerability to environmental insult, with damage resulting in hearing and balance disorders. An important example is hair cell loss due to exposure to toxic agents including therapeutic drugs such as the aminoglycoside antibiotics neomycin and gentamicin and antineoplastic agents. We describe two distinct cellular pathways for aminoglycoside-induced hair cell death in zebrafish lateral line hair cells. Neomycin exposure results in death from acute exposure with most cells dying within 1 h of exposure. By contrast, exposure to gentamicin results primarily in delayed hair cell death, taking up to 24 h for maximal effect. Washout experiments demonstrate that delayed death does not require continuous exposure, demonstrating two mechanisms where downstream responses differ in their timing. Acute damage is associated with mitochondrial calcium fluxes and can be alleviated by the mitochondrially-targeted antioxidant mitoTEMPO, while delayed death is independent of these factors. Conversely delayed death is associated with lysosomal accumulation and is reduced by altering endolysosomal function, while acute death is not sensitive to lysosomal manipulations. These experiments reveal the complexity of responses of hair cells to closely related compounds, suggesting that intervention focusing on early events rather than specific death pathways may be a successful therapeutic strategy.

Hearing and balance deficits have been reported during and following treatment with the antimalarial drug chloroquine. However, experimental work examining the direct actions of chloroquine on mechanoreceptive hair cells in common experimental models is lacking. This study examines the effects of chloroquine on hair cells using two common experimental models: the zebrafish lateral line and neonatal mouse cochlear cultures. Zebrafish larvae were exposed to varying concentrations of chloroquine phosphate or hydroxychloroquine for 1 hr or 24 hr, and hair cells assessed by antibody staining. A significant, dose-dependent reduction in the number of surviving hair cells was seen across conditions for both exposure periods. Hydroxycholroquine showed similar toxicity. In mouse cochlear cultures, chloroquine damage was specific to outer hair cells in tissue from the cochlear basal turn, consistent with susceptibility to other ototoxic agents. These findings suggest a need for future studies employing hearing and balance monitoring during exposure to chloroquine and related compounds, particularly with interest in these compounds as therapeutics against viral infections including coronavirus.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Mechanosensory hair cells of the inner ears and lateral line of vertebrates display heightened vulnerability to environmental insult, with damage resulting in hearing and balance disorders. An important example is hair cell loss due to exposure to toxic agents including therapeutic drugs such as the aminoglycoside antibiotics such as neomycin and gentamicin and antineoplastic agents. We describe two distinct cellular pathways for aminoglycoside-induced hair cell death in zebrafish lateral line hair cells. Neomycin exposure results in death from acute exposure with most cells dying within 1 hour of exposure. By contrast, exposure to gentamicin results primarily in delayed hair cell death, taking up to 24 hours for maximal effect. Washout experiments demonstrate that delayed death does not require continuous exposure, demonstrating two mechanisms where downstream responses differ in their timing. Acute damage is associated with mitochondrial calcium fluxes and can be alleviated by the mitochondrially-targeted antioxidant mitoTEMPO, while delayed death is independent of these factors. Conversely delayed death is associated with lysosomal accumulation and is reduced by altering endolysosomal function, while acute death is not sensitive to lysosomal manipulations. These experiments reveal the complexity of responses of hair cells to closely related compounds, suggesting that intervention focusing on early events rather than specific death pathways may be a successful therapeutic strategy.

Abstract There are no approved therapeutics for the prevention of hearing loss and vestibular dysfunction from drugs like aminoglycoside antibiotics. While the mechanisms underlying aminoglycoside ototoxicity remain unresolved, there is considerable evidence that aminoglycosides enter inner ear mechanosensory hair cells through the mechanoelectrical transduction (MET) channel. Inhibition of MET-dependent uptake with small molecules or modified aminoglycosides is a promising otoprotective strategy. To better characterize mammalian ototoxicity and aid in the translation of emerging therapeutics, a biomarker is needed. In the present study we propose that neonatal mice systemically injected with the aminoglycosides G418 conjugated to Texas Red (G418-TR) can be used as a histologic biomarker to characterize in vivo aminoglycoside toxicity. We demonstrate that postnatal day 5 mice, like older mice with functional hearing, show uptake and retention of G418-TR in cochlear hair cells following systemic injection. When we compare G418-TR uptake in other tissues, we find that kidney proximal tubule cells show similar retention. Using ORC-13661, an investigational hearing protection drug, we demonstrate in vivo inhibition of aminoglycoside uptake in mammalian hair cells. This work establishes how systemically administered fluorescently labeled ototoxins in the neonatal mouse can reveal important details about ototoxic drugs and protective therapeutics.