Summary

 RORγt is well recognized as the lineage-defining transcription factor for T helper 17 (T_H17) cell development. However, the cell-intrinsic mechanisms that negatively regulate T_H17 cell development and autoimmunity remain poorly understood. Here, we demonstrate that the transcriptional repressor REV-ERBα is exclusively expressed in T_H17 cells, competes with RORγt for their shared DNA consensus sequence, and negatively regulates T_H17 cell development via repression of genes traditionally characterized as RORγt dependent, including Il17a. Deletion of REV-ERBα enhanced T_H17-mediated pro-inflammatory cytokine expression, exacerbating experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and colitis. Treatment with REV-ERB-specific synthetic ligands, which have similar phenotypic properties as RORγ modulators, suppressed T_H17 cell development, was effective in colitis intervention studies, and significantly decreased the onset, severity, and relapse rate in several models of EAE without affecting thymic cellularity. Our results establish that REV-ERBα negatively regulates pro-inflammatory T_H17 responses in vivo and identifies the REV-ERBs as potential targets for the treatment of T_H17-mediated autoimmune diseases.

ABSTRACT PPARγ is a nuclear receptor transcription factor that regulates adipogenic and insulin sensitizing gene programs via two activation function (AF) regulatory domains: a ligand-dependent AF-2 coregulator interaction surface within the C-terminal ligand-binding domain (LBD) and an N-terminal disordered AF-1 domain (NTD or A/B region). Here, we show the AF-1 contains an evolutionary conserved Trp-Pro motif that populates two long-lived AF-1 conformations via proline cis/trans isomerization. The Trp-Pro motif participates in transient intradomain AF-1 contacts and interdomain contacts with two surfaces of the LBD (β-sheet and AF-2). Mutagenesis indicates the Pro residue negatively regulates PPARγ transcriptional output, suggesting a potential regulatory mechanism for AF-1 isomerization. Our findings provide a structural rationale to explain previous in vitro and cellular studies that reported interdomain functional communication between the PPARγ AF-1 and LBD. Our study also illuminates a structural biology platform to study how disordered domains in nuclear receptors influence their structure and function.

Crystal structures of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma have revealed overlapping binding modes for synthetic and natural ligands, indicating competition for the orthosteric pocket. Here we show that cobinding of a synthetic orthosteric ligand and a medium-chain fatty acid to a nonorthosteric alternate site forms a "ligand link" to the functionally important Ω-loop that synergistically affects PPARγ structure and function. Synthetic ligand extensions within the orthosteric pocket can "push" fatty acid cobinding modes towards the Ω-loop, and our retrospective analysis of the electron density of other PPARγ crystal structures bound to synthetic ligands identified alternate site density consistent with a cobound natural ligand. Mutagenesis studies indicate that residues contacting the cobound fatty acid may be important for basal cellular PPARγ activity and activation by synthetic ligands. These findings contribute to a growing body of evidence indicating ligand binding to nuclear receptors can be more complex than the classical one-for-one orthosteric exchange of natural and synthetic ligands.

The thiazolidinedione (TZD) pioglitazone (Pio) is an FDA-approved drug for type 2 diabetes mellitus that binds and activates the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ). Although TZDs have potent antidiabetic effects, they also display harmful side effects that have necessitated a better understanding of their mechanisms of action. In particular, little is known about the effect of in vivo TZD metabolites on the structure and function of PPARγ. Here, we present a structure-function comparison of Pio and a major in vivo metabolite, 1-hydroxypioglitazone (PioOH). PioOH displayed a lower binding affinity and reduced potency in coregulator recruitment assays compared to Pio. To determine the structural basis of these findings, we solved an X-ray crystal structure of PioOH bound to PPARγ ligand-binding domain (LBD) and compared it to a published Pio-bound crystal structure. PioOH exhibited an altered hydrogen bonding network that could underlie its reduced affinity and potency compared to Pio. Solution-state structural analysis using NMR spectroscopy and hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) analysis revealed that PioOH stabilizes the PPARγ activation function-2 (AF-2) coactivator binding surface better than Pio. In support of AF-2 stabilization, PioOH displayed stabilized coactivator binding in biochemical assays and better transcriptional efficacy (maximal transactivation response) in a cell-based assay that reports on the activity of the PPARγ LBD. These results, which indicate that Pio hydroxylation affects both its potency and efficacy as a PPARγ agonist, contribute to our understanding of PPARγ-binding drug metabolite interactions and may assist in future PPARγ drug design efforts.

ABSTRACT Heme is the endogenous ligand for the constitutively repressive REV-ERB nuclear receptors, REV-ERBα (NR1D1) and REV-ERBβ (NR1D2), but how heme regulates REV-ERB activity remains unclear. While cellular studies indicate heme is required for the REV-ERBs to bind the corepressor NCoR and repress transcription, fluorescence-based biochemical assays and crystal structures suggest that heme displaces NCoR. Here, we show that heme artifactually influences detection of NCoR interaction in fluorescence-based assays. However, using fluorescence-independent methods, isothermal titration calorimetry and NMR spectroscopy, we demonstrate that heme directly increases REV-ERBβ ligand-binding domain (LBD) binding affinity for NCoR. We further report two crystal structures of REV-ERBβ LBD cobound to heme and NCoR peptides, which reveal the structural basis for heme-dependent NCoR binding to REV-ERBβ. By resolving previous contradictory biochemical, structural, and cellular studies, our findings should facilitate renewed progress toward understanding heme-dependent REV-ERB activity.

Bile acids (BAs) are lipid emulsifying metabolites synthesized in hepatocytes and maintained in vivo through enterohepatic circulation between the liver and small intestine 1 . As detergents, BAs can cause toxicity and inflammation in enterohepatic tissues 2 . Nuclear receptors maintain BA homeostasis in hepatocytes and enterocytes 3 , but it is unclear how mucosal immune cells tolerate high BA concentrations in the small intestine lamina propria (siLP). We previously reported that CD4 + T effector (Teff) cells upregulate expression of the xenobiotic transporter MDR1/ ABCB1 in the siLP to prevent BA toxicity and suppress Crohn’s disease-like small bowel inflammation 4 . Here, we identify the nuclear xenobiotic receptor, constitutive androstane receptor (CAR/ NR1I3 ), as a regulator of MDR1 expression in T cells, and safeguard against BA toxicity and inflammation in the small intestine. CAR was activated and induced large-scale transcriptional reprograming in Teff cells infiltrating the siLP, but not the colon. CAR induced expression of detoxifying enzymes and transporters in siLP Teff cells, as in hepatocytes, but also the key anti-inflammatory cytokine, Il10 . Accordingly, CAR-deficiency in T cells exacerbated, whereas pharmacologic CAR activation suppressed, BA-driven ileitis in T cell-reconstituted Rag −/− mice. These data suggest that CAR acts locally in small intestinal T cells to detoxify BAs and resolve inflammation. Activation of this program offers an unexpected strategy to treat small bowel Crohn’s disease, and provides evidence of lymphocyte sub-specialization within the small intestine.