Summary The generation of high-quality antibody responses to PfCSP, the primary surface antigen of Plasmodium falciparum sporozoites, is paramount to the development of an effective malaria vaccine. Here we present an in-depth structural and functional analysis of a panel of potent antibodies encoded by the IGHV3-33 germline gene, which is among the most prevalent and potent antibody families induced in the anti-CSP immune response and targets the NANP repeat region. Cryo-EM reveals a remarkable spectrum of helical Fab-CSP structures stabilized by homotypic interactions between tightly packed Fabs, many of which correlate with somatic hypermutation. We demonstrate a key role of these mutated homotypic contacts for high avidity binding to CSP and in protection from P. falciparum malaria infection. These data emphasize the importance of anti-homotypic affinity maturation in the frequent selection of IGHV3-33 antibodies, advance our understanding of the mechanism(s) of antibody-mediated protection, and inform next generation CSP vaccine design.

Abstract The most advanced P. falciparum circumsporozoite protein (PfCSP)-based malaria vaccine, RTS,S/AS01 (RTS,S), confers partial protection but with antibody titers that wane relatively rapidly, highlighting the need to elicit more potent and durable antibody responses. Here, we elucidate crystal structures, binding affinities and kinetics, and in vivo protection of eight anti-NANP antibodies (Abs) derived from an RTS,S phase 2a trial and encoded by three different heavy-chain germline genes. The structures reinforce the importance of homotypic Fab-Fab interactions in protective Abs and the overwhelmingly dominant preference for a germline-encoded aromatic residue for recognition of the NANP motif. A number of biophysical properties were analyzed and antibody affinity correlated best with protection in an in vivo mouse model, with the more potent antibodies also recognizing epitopes with repeating secondary structural motifs of type I β- and Asn pseudo 3 10 turns. Such insights can be incorporated into design of more effective immunogens as well as antibodies for passive immunization.

The opioid overdose crisis primarily driven by potent synthetic opioids resulted in more than 500,000 deaths in the US over the last 20 years. Though naloxone, a short acting medication, remains the primary treatment option for temporarily reversing opioid overdose effects, alternative countermeasures are needed. Monoclonal antibodies present a versatile therapeutic opportunity that can be tailored for synthetic opioids and that can help prevent post-treatment renarcotization. The ultrapotent analog carfentanil, is especially concerning due to its unique pharmacological properties. With this in mind, we generated a fully human antibody through a drug-specific B cell sorting strategy with a combination of carfentanil and fentanyl probes. The resulting pan-specific antibody was further optimized through scFv phage display. This antibody, C10-S66K, displays high affinity to carfentanil, fentanyl, and other analogs, and reversed carfentanil-induced respiratory depression. Additionally, x-ray crystal structures with carfentanil and fentanyl bound provided structural insight into key drug:antibody interactions.

Abstract The symptoms of malaria occur during the blood stage of infection, when the parasite replicates within human red blood cells. The human malaria parasite, Plasmodium vivax , selectively invades reticulocytes in a process which requires an interaction between the ectodomain of the human DARC receptor and the Plasmodium vivax Duffy-binding protein, PvDBP. Previous studies have revealed that a small helical peptide from DARC binds to region II of PvDBP (PvDBP-RII). However, it is also known that sulphation of tyrosine residues on DARC affects its binding to PvDBP and these residues were not observed in previous structures. We have therefore determined the structure of PvDBP-RII bound to sulphated DARC peptide, showing that a sulphate on tyrosine 41 binds to a charged pocket on PvDBP-RII. We use molecular dynamics simulations, affinity measurements and growth-inhibition experiments in parasites to confirm the importance of this interaction. We also reveal the epitope for vaccine-elicited growth-inhibitory antibody, DB1. This provides a complete understanding of the binding of PvDBP-RII to DARC and will guide the design of vaccines and therapeutics to target this essential interaction.

Malaria is a global health concern and research efforts are ongoing to develop a superior vaccine to RTS,S/AS01. To guide immunogen design, we seek a comprehensive understanding of the protective humoral response against Plasmodium falciparum circumsporozoite protein (PfCSP). In contrast to the well-studied responses to the repeat region and the C-terminus, the antibody response against the N-terminal domain of PfCSP (N-CSP) remains obscure. Here, we characterized the molecular recognition and functional efficacy of the N-CSP-specific monoclonal antibody 5D5. The crystal structure at 1.85 Å resolution revealed that α-helical epitope in N-CSP with high affinity through extensive shape and charge complementarity, and the unusual utilization of an N-linked glycan. Nevertheless, functional studies indicated low 5D5 binding to live Pf sporozoites, and lack of sporozoite inhibition in vitro and in mosquitoes. Overall, our data on low recognition and inhibition of sporozoites do not support the inclusion of the 5D5 epitope into the next generation of CSP-based vaccines.

Abstract A primary objective in malaria vaccine design is the generation of high-quality antibody responses against the circumsporozoite protein of the malaria parasite, Plasmodium falciparum (PfCSP). To enable rational antigen design, we solved a cryo-EM structure of the highly potent anti-PfCSP antibody L9 in complex with recombinant PfCSP. We found that L9 Fab binds multivalently to the CSP minor (NPNV) repeats, which is stabilized by a novel set of affinity-matured homotypic, antibody-antibody contacts. Molecular dynamics simulations revealed a critical role of the L9 light chain in integrity of the homotypic interface, which likely impacts CSP affinity and protective efficacy. These findings reveal the molecular mechanism of the unique NPNV selectivity of L9 and emphasize the importance of anti-homotypic affinity maturation in protective immunity against P. falciparum . One sentence summary The L9 light chain is crucial for potency by conferring multivalent, high affinity binding to the NPNV minor repeats of PfCSP.

Plasmodium vivax remains one of the major causative agents of human malaria and a vaccine is urgently required. It is an obligate intracellular parasites and replication within red blood cells is essential for development of disease and for transmission. The interaction between PvDBP on the parasite surface and the DARC receptor on human reticulocytes is essential for a Plasmodium vivax blood stage infection. Human vaccination with the RII region of PvDBP slowed parasite replication, showing that PvDBP is a promising vaccine candidate. However, it did not induce sterile protection, and further development is required to generate a vaccine which protects from clinical malaria. In this study, we develop a vaccine immunogen containing a region of PvDBP-RII, known as subdomain 3, which contains the epitope for a broadly-reactive growth-inhibitory antibody, DB9. We used structure-guided approaches to resurface subdomain 3 such that it folds as an isolated molecule. We show that this engineered subdomain 3 is more stable and more easily produced than PvDBP-RII and induces a more effective growth-inhibitory antibody response. We therefore present an improved PvDBP-based immunogen for use in blood stage vaccines to prevent malaria due to Plasmodium vivax.

Antibody discovery is crucial for developing therapeutics and vaccines as well as understanding adaptive immunity. However, the lack of approaches to synthesize antibodies with defined sequences in a high-throughput manner represents a major bottleneck in antibody discovery. Here, we presented oPool + display, which combines oligo pool synthesis and mRNA display to construct and characterize the specificity of many natively paired antibodies in parallel. As a proof-of-concept, we applied oPool + display to rapidly screen the binding activity of >300 natively paired influenza hemagglutinin (HA) antibodies against the conserved HA stem domain. Structural analysis of 16.ND.92, one of the identified HA stem antibodies, revealed a unique binding mode distinct from other known broadly neutralizing stem antibodies with the same sequence feature. Yet, despite such differences, 16.ND.92 remained broadly reactive and conferred in vivo protection. Overall, this study not only established an experimental platform to accelerate antibody discovery, but also provides molecular insights into antibody responses to the influenza HA stem, which is a major target for universal influenza vaccine development.