Abstract Cells acquire the polyamines putrescine (PUT), spermidine (SPD) and spermine (SPM) via the complementary action of polyamine uptake and synthesis pathways. The endosomal P 5B -type ATPases ATP13A2 and ATP13A3 emerge as major determinants of mammalian polyamine uptake. Our biochemical evidence shows that fluorescently labeled polyamines are genuine substrates of ATP13A2. They can be used to measure polyamine uptake in ATP13A2 and ATP13A3-dependent cell models resembling radiolabeled polyamine uptake. We further report that ATP13A3 enables faster and stronger cellular polyamine uptake than ATP13A2. We also compared the uptake of new green-fluorescent PUT, SPD and SPM analogs using different coupling strategies (amide, triazole or isothiocyanate) and fluorophores (symmetrical BODIPY, BODIPY-FL and FITC). ATP13A2 promotes the uptake of various SPD and SPM analogs, whereas ATP13A3 mainly stimulates the uptake of PUT and SPD conjugates. However, the polyamine linker and coupling position on the fluorophore impacts the transport capacity, whereas replacing the fluorophore affects polyamine selectivity. The highest uptake in ATP13A2 or ATP13A3 cells is observed with BODIPY-FL-amide conjugated to SPD, whereas BODIPY-PUT analogs are specifically taken up via ATP13A3. We found that P 5B -type ATPase isoforms transport fluorescently labeled polyamine analogs with a distinct structure-activity relationship (SAR) suggesting that isoform-specific polyamine probes can be designed.

Abstract Congenital myasthenic syndrome-22 (CMS22) is a rare genetic disorder caused by mutations in the prolyl endopeptidase-like ( PREPL ) gene. Since previous reports only described patients with deletions and nonsense mutations in PREPL , nothing is known about the effect of missense mutations in the pathology of CMS22. In this study, we have characterized missense mutations in PREPL in three CMS22 patients, all with hallmark phenotypes. Biochemical evaluation revealed that these missense mutations do not impair hydrolase activity, thereby challenging the conventional diagnostic criteria. Structural analysis shows that the mutations affect regions most likely involved in intra-protein or protein-protein interactions. Indeed, binding to a selected group of known interactors was differentially reduced for the three mutants. The importance of non-hydrolytic functions of PREPL was investigated in catalytically inactive PREPL p.Ser559Ala cell lines which showed that hydrolytic activity of PREPL is needed for normal mitochondrial function but not for regulating AP1-mediated transport in the trans-Golgi network. In conclusion, these studies show that CMS22 can be caused not only by deletion and truncation of PREPL but also by missense mutations that do not necessarily result in a loss of hydrolytic activity of PREPL. Graphical abstract

Quenched activity-based probes (qABP) are invaluable tools to visualize aberrant protease activity. Unfortunately, most studies so far have only focused on cysteine proteases, and only a few studies describe the synthesis and use of serine protease qABPs. We recently used phosphinate ester electrophiles as a novel type of reactive group to construct ABPs for serine proteases. Here, we report on the construction of qABPs based on the phosphinate warhead, exemplified by probes for the neutrophil serine proteases. The most successful probes show sub-stoichiometric reaction with human neutrophil elastase, efficient fluorescence quenching, and rapid unquenching of fluorescence upon reaction with target proteases.