Abstract The type II secretion system (T2SS) is a multi-protein envelope-spanning assembly that translocates a wide range of virulence factors, enzymes and effectors through the outer membrane (OM) of many Gram-negative bacteria. Here, using electron cryotomography and subtomogram averaging methods, we present the first in situ structure of an intact T2SS, imaged within the human pathogen Legionella pneumophila. Although the T2SS has only limited sequence and component homology with the evolutionarily-related Type IV pilus (T4P) system, we show that their overall architectures are remarkably similar. Despite similarities, there are also differences, including for instance that the T2SS-ATPase complex is usually present but disengaged from the inner membrane, the T2SS has a much longer periplasmic vestibule, and it has a short-lived flexible pseudopilus. Placing atomic models of the components into our ECT map produced a complete architectural model of the intact T2SS that provides new insights into the structure and function of its components, its position within the cell envelope, and the interactions between its different subcomplexes. Overall, these structural results strongly support the piston model for substrate extrusion.

ABSTRACT Coxiella burnetii is an obligate zoonotic bacterium that targets macrophages to cause a disease known as Q fever. It has a biphasic developmental lifecycle where the extracellular and metabolically inactive small cell variant (SCV) transforms, under host acidic environment, into the vegetative large cell variant (LCV). However, the details about the morphological and structural changes that accompany this biphasic cycle are still lacking. Here, we used cryo-electron tomography to image the different cell variants of C. burnetii grown either under axenic conditions in different pH or purified directly from host cells revealing the major developmental, morphological and structural transitions. We show that SCVs are characterized by equidistant stacks of inner membrane that presumably allow a smooth transition to LCV, a transition coupled with the expression of the Dot/Icm type IVB secretion system (T4BSS). A class of T4BSS particles were associated with extracellular densities including a tubular structure possibly involved in host interaction or effector delivery. Also, SCVs and cells in the transition state contained spherical multilayered membrane structures of different sizes and locations suggesting that they are not related to a sporulation process as once assumed.

The self-assembly of cellular macromolecular machines such as the bacterial flagellar motor requires the spatio- temporal synchronization of gene expression, protein localization and association of a dozen or more unique components. In Salmonella and Escherichia coli, a sequential, outward assembly mechanism has been proposed for the flagellar motor starting from the inner membrane, with each subsequent component stabilizing the last. Here, using electron cryo-tomography of intact Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa and Shewanella oneidensis cells, we observe stable outer-membrane-embedded sub-complexes of the flagellar motor. These sub- complexes consist of the periplasmic embellished P- and L-rings, in the absence of other flagellar components, and bend the membrane inward dramatically. Additionally, we also observe independent inner-membrane sub- complexes consisting of the C- and MS-rings and export apparatus. These results suggest an alternate model for flagellar motor assembly in which outer- and inner-membrane-associated sub-complexes form independently and subsequently join, enabling later steps of flagellar production to proceed.

The bacterial flagellar motor is an amazing nanomachine. Understanding how such complex structures arose is crucial to our understanding of cellular evolution. We and others recently reported that in several Gammaproteobacterial species, a relic sub-complex comprising the P- and L-rings persists in the outer membrane after flagellum disassembly. Imaging nine additional species with cryo-electron tomography, here we show that this sub-complex persists after flagellum disassembly in other phyla as well. Bioinformatic analyses fail to show evidence of any recent horizontal transfers of the P- and L-ring genes, suggesting that this sub-complex and its persistence is an ancient and conserved feature of the flagellar motor. We hypothesize that one function of the P- and L-rings is to seal the outer membrane after motor disassembly.

To divide, Gram-negative bacterial cells must remodel their peptidoglycan cell wall to a smaller and smaller radius at the division site, but how this process occurs remains debated. While the tubulin homolog FtsZ is thought to generate a constrictive force, it has also been proposed that cell wall remodeling alone is sufficient to drive membrane constriction, possibly via a make-before-break mechanism in which new hoops of cell wall are made inside the existing hoops (make) before bonds in the existing wall are cleaved (break). Previously, we constructed software, REMODELER 1, to simulate cell wall remodeling in rod-shaped bacteria during growth. Here, we used this software as the basis for an expanded simulation system, REMODELER 2, which we used to explore different mechanistic models of cell wall division. We found that simply organizing the cell wall synthesis complexes at the midcell was not sufficient to cause wall invagination, even with the implementation of a make-before-break mechanism. Applying a constrictive force at the midcell could drive division if the force was sufficiently large to initially constrict the midcell into a compressed state before new hoops of relaxed cell wall were incorporated between existing hoops. Adding a make-before-break mechanism could drive division with a smaller constrictive force sufficient to bring the midcell peptidoglycan into a relaxed, but not necessarily compressed, state.

Abstract Bdellovibrio bacteriovorus is an endobiotic microbial predator that offers promise as a living antibiotic for its ability to kill Gram-negative bacteria, including human pathogens. Even after six decades of study, fundamental details of its predation cycle remain mysterious. Here, we used cryo-electron tomography to comprehensively image the lifecycle of B. bacteriovorus at nanometer-scale resolution. In addition to providing the first high-resolution images of predation in a native (hydrated, unstained) state, we also discover several surprising features of the process, including novel macromolecular complexes involved in prey attachment/invasion and a flexible portal structure lining a hole in the prey peptidoglycan that tightly seals the prey outer membrane around the predator during entry. Unexpectedly, we find that B. bacteriovorus does not shed its flagellum during invasion, but rather resorbs it into its periplasm for degradation. Finally, following replication and division in the bdelloplast, we observe a transient and extensive ribosomal lattice on the condensed B. bacteriovorus nucleoid. Graphical abstract

Abstract The ability to produce membrane projections in the form of tubular membrane extensions (MEs) and membrane vesicles (MVs) is a widespread phenomenon among bacteria. Despite this, our knowledge of the ultrastructure of these extensions and their associated protein complexes remains limited. Here, we surveyed the ultrastructure and formation of MEs and MVs, and their associated protein complexes, in tens of thousands of electron cryo-tomograms of ∼ 90 bacterial species that we have collected for various projects over the past 15 years (Jensen lab database), in addition to data generated in the Briegel lab. We identified MEs and MVs in 13 species and classified several major ultrastructures: 1) tubes with a uniform diameter (with or without an internal scaffold), 2) tubes with irregular diameter, 3) tubes with a vesicular dilation at their tip, 4) pearling tubes, 5) connected chains of vesicles (with or without neck-like connectors), 6) budding vesicles and nanopods. We also identified several protein complexes associated with these MEs and MVs which were distributed either randomly or exclusively at the tip. These complexes include a secretin-like structure and a novel crown-shaped structure observed primarily in vesicles from lysed cells. In total, this work helps to characterize the diversity of bacterial membrane projections and lays the groundwork for future research in this field.

Abstract Using a new Titan Krios stage equipped with a single-axis holder, we developed two methods to accelerate the collection of tilt-series. We demonstrate a continuous-tilting method that can record a tilt-series in seconds (about 100x faster than current methods), but with loss of details finer than ∼4 nm. We also demonstrate a fast-incremental method that can record a tilt-series about 10x faster than current methods and with similar resolution. We characterize the utility of both methods in real biological electron cryotomography workflows. We identify opportunities for further improvements in hardware and software and speculate on the impact such advances could have on structural biology.

Abstract The flagellar type III secretion system (fT3SS) is a suite of membrane-embedded and cytoplasmic proteins responsible for building the bacterial flagellar motility machinery. Homologous proteins form the injectisome machinery bacteria use to deliver effector proteins into eukaryotic cells, and other family members have recently been reported to be involved in the formation of membrane nanotubes. Here we describe a novel, ubiquitous and evolutionarily widespread hat-shaped structure embedded in the inner membrane of bacteria, of yet-unidentified function, that is related to the fT3SS, adding to the already rich repertoire of this family of nanomachines.

The bacterial flagellar motor is a cell-envelope-embedded macromolecular machine that functions as a propeller to move the cell. Rather than being an invariant machine, the flagellar motor exhibits significant variability between species, allowing bacteria to adapt to, and thrive in, a wide range of environments. For instance, different torque- generating stator modules allow motors to operate in conditions with different pH and sodium concentrations and some motors are adapted to drive motility in high-viscosity environments. How such diversity evolved is unknown. Here we use electron cryo-tomography to determine the in situ macromolecular structures of the flagellar motors of three Gammaproteobacteria species: Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, and Shewanella oneidensis MR-1, providing the first views of intact motors with dual stator systems. Complementing our imaging with bioinformatics analysis, we find a correlation between the stator system of the motor and its structural complexity. Motors with a single H+-driven stator system have only the core P- and L-rings in their periplasm; those with dual H+-driven stator systems have an extra component elaborating their P-ring; and motors with Na+- (or dual Na+-H+)- driven stator systems have additional rings surrounding both their P- and L-rings. Our results suggest an evolution of structural complexity that may have enabled pathogenic bacteria like L. pneumophila and P. aeruginosa to colonize higher-viscosity environments in animal hosts.