Epidemic C. difficile (027/BI/NAP1) has rapidly emerged in the past decade as the leading cause of antibiotic-associated diarrhea worldwide. However, the key events in evolutionary history leading to its emergence and the subsequent patterns of global spread remain unknown. Here, we define the global population structure of C. difficile 027/BI/NAP1 using whole-genome sequencing and phylogenetic analysis. We show that two distinct epidemic lineages, FQR1 and FQR2, not one as previously thought, emerged in North America within a relatively short period after acquiring the same fluoroquinolone resistance-conferring mutation and a highly related conjugative transposon. The two epidemic lineages showed distinct patterns of global spread, and the FQR2 lineage spread more widely, leading to healthcare-associated outbreaks in the UK, continental Europe and Australia. Our analysis identifies key genetic changes linked to the rapid transcontinental dissemination of epidemic C. difficile 027/BI/NAP1 and highlights the routes by which it spreads through the global healthcare system.

The microbiome dysbiosis caused by antibiotic treatment has been associated with both susceptibility to and relapse of Clostridium difficile infection (CDI). Bacteriophage (phage) therapy offers target specificity and dose amplification in situ, but few studies have focused on its use in CDI treatment. This mainly reflects the lack of strictly virulent phages that target this pathogen. While it is widely accepted that temperate phages are unsuitable for therapeutic purposes due to their transduction potential, analysis of seven C. difficile phages confirmed that this impact could be curtailed by the application of multiple phage types. Here, host range analysis of six myoviruses and one siphovirus was conducted on 80 strains representing 21 major epidemic and clinically severe ribotypes. The phages had complementary coverage, lysing 18 and 62 of the ribotypes and strains tested, respectively. Single-phage treatments of ribotype 076, 014/020, and 027 strains showed an initial reduction in the bacterial load followed by the emergence of phage-resistant colonies. However, these colonies remained susceptible to infection with an unrelated phage. In contrast, specific phage combinations caused the complete lysis of C. difficile in vitro and prevented the appearance of resistant/lysogenic clones. Using a hamster model, the oral delivery of optimized phage combinations resulted in reduced C. difficile colonization at 36 h postinfection. Interestingly, free phages were recovered from the bowel at this time. In a challenge model of the disease, phage treatment delayed the onset of symptoms by 33 h compared to the time of onset of symptoms in untreated animals. These data demonstrate the therapeutic potential of phage combinations to treat CDI.

ABSTRACT Background Clostridium perfringens is an anaerobic toxin-producing bacterium that has long been associated with intestinal diseases, particularly in neonatal humans and animals. More recently, infant gut microbiome studies have suggested an important link between C. perfringens and the devastating preterm-associated disease Necrotising Enterocolitis (NEC), but in-depth studies on this pathogen (genomics and mechanistic) are lacking. Methods/Materials We isolated and whole-genome sequenced 274 infant-associated C. perfringens isolates from 5 hospitals across the UK between 2011-2016 (including longitudinal samples from 31 individuals). We performed in-depth genomic analyses, phenotypically characterised pathogenic traits of 10 strains (including 4 C. perfringens from NEC patients) and established a novel oral-challenge C57BL/6 mouse infection model for microbe-host studies. Results Pore-forming toxin encoding genes pfoA and cpb2 were enriched within hypervirulent lineages that exclusively consisted of C. perfringens -associated NEC (CPA-NEC) strains, in addition to overabundance of colonisation factors. Importantly, we identified a circulating C. perfringens variant, eventually linked to a fatal CPA-NEC case. The variant was detected consistently within 6 individuals in two sister hospitals across a 40-day window, demonstrating for the first time the intra- and inter-hospital dissemination of C. perfringens . CPA-NEC isolates were determined phenotypically to be more virulent (linked with overabundance of gene pfoA ) than isolates obtained from non-NEC preterm babies. In addition, two pfoA -positive CPA-NEC C. perfringens strains were confirmed to induce clinical inflammatory tissue lesions in vivo . Conclusions Hypervirulent lineages are linked to CPA-NEC, potentially due to the production of pore-forming toxins, coupled with higher metabolic, transmission, and pathogenic capacities. These studies indicate C. perfringens is an important bacterial pathogen in preterm infants and highlights the requirement for further investigation into development of intervention and therapeutic strategies.

Abstract Mucosal biofilms play an important role in intestinal health; however, the mucosal bacterial community has been implicated in persistent infections. Clostridioides difficile is an important nosocomial pathogen, with an unacceptable high rate of recurrence following antibiotic treatment. As C. difficile is a known biofilm producer, a property which may contribute to this suboptimal therapeutic response, we have investigated the transcriptional changes and regulatory pathways during the transition from planktonic to biofilm mode of growth. Widespread metabolic reprogramming during biofilm formation was detected, characterised by an increased usage of glycine metabolic pathways to yield key metabolites, which are used for energy production and synthesis of short chain fatty acids. We detected the expression of 107 small non-coding RNAs that appear to, in some part, regulate these pathways; however, 25 of these small RNAs were specifically expressed during biofilm formation, indicating they may play a role in regulating biofilm-specific genes. Similar to Bacillus subtilis , biofilm formation is a multi-regulatory process and SinR negatively regulates biofilm formation independently of other known mechanisms. This comprehensive analysis furthers our understanding of biofilm formation in C. difficile , identifies potential targets for anti-virulence factors, and provides evidence of the link between metabolism and virulence traits.

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are the most common cause of urinary tract infections, which pose a great burden on global health and the economy through morbidity, mortality, healthcare costs and loss of productivity. Pooled human urine can be used as a growth medium for in vitro studies, however even if the same donors are used, composition can vary depending largely on diet and fluid intake. There have been a number of artificial urine formulae used as alternatives to pooled human urine. However, we observed that a recently reported multipurpose artificial urine was unable to support the growth of prototypic UPEC strains suggesting it lacked key metabolites. We therefore used liquid chromatography mass spectrometry to identify and adjust the metabolic profile of multipurpose artificial urine closer to that of pooled human urine. Modification in this way facilitated growth of UPEC strains with growth rates similar to those obtained in pooled human urine. Transcriptomic analysis of UPEC strains cultured in enhanced artificial urine and pooled human urine showed that the gene expression profiles are similar, with less than 7% of genes differentially expressed between the two conditions. The data support this enhanced artificial urine as a robust media to study aspects of UPEC physiology in vitro.

Here, we report the incidental isolation and genome sequencing of an E. coli O157:H7 strain isolated from the faeces of commercial, specific-pathogen free mice (BALB/c). The isolate, subsequently named EC_MP01 was found to carry both Shiga toxin 2a and the Locus of Enterocyte Effacement (LEE) pathogenicity island, major virulence factors associated with severe disease in humans. This report draws attention to the limitations of existing screening systems and highlights how strain carriage influence the outputs from such studies.

Abstract Clostridioides difficile is responsible for substantial morbidity and mortality in antibiotically-treated, hospitalised, elderly patients, in which toxin production correlates with diarrhoeal disease. While the function of these toxins has been studied in detail, the contribution of other factors, including the paracrystalline surface layer (S-layer), to disease is less well known. Here, we highlight the essentiality of the S-layer in vivo by reporting the recovery of S-layer revertants, following infection with the S-layer-null strain, FM2.5. Sequencing of the slp A gene revealed either correction of the original point mutation or modification of the sequence upstream of the mutation, which restored the reading frame, and translation of slpA . Selection of these strains was rapid, with up to 90% of isolates identified as revertants 24 h post infection. Two revertant isolates, RvA and RvB, showed modification of 3 and 13 amino acids respectively, compared to wild type sequence. Structural determination of SlpA from RvB revealed a different orientation of its domains, resulting in a reorganisation of the lattice assembly and changes in interacting interfaces which might result in functional differences. These revertants showed differing patterns of disease i n vivo ; RvA causing equivalent severity to R20291 and RvB an attenuated FM2.5-like phenotype. Comparative RNA sequencing (RNA-Seq) analysis of in vitro grown isolates showed large changes in differentially expressed genes (DEGs) between R20291 and FM2.5 namely in TcdA/TcdB expression, in transcripts associated with sporulation and those linked to cell wall integrity, which may account for attenuation observed in vivo . In comparison, smaller differences were observed between RvA/R20291, and RvB/FM2.5 respectively, which correlated with observed disease severity in vivo . Cumulatively, these data highlight that the S-layer plays a role in C. difficile disease. Author Summary The S-layer of C. difficile is a paracrystalline array that covers the outer surface of the bacterial cell but its contribution to overall disease remains unclear. A previously described, spontaneous slpA -null mutant, FM2.5, with a point mutation in slp A offered an opportunity to study the role of the S-layer in vivo . Here, we confirm that this strain is less virulent in vivo despite effectively colonising the host and producing toxin. We also show in vivo selection for sequence modifications that restore slp A translation and produce an S-layer. While such modifications do not affect the overall 3D structure of individual SlpA (sub)domains, they can lead to altered orientation of the structural domains and subsequent S-layer assembly. Importantly, RNA-Seq analysis in vitro showed large differences in gene expression between FM2.5 and R20291. Detected differences in transcription of genes involved in toxin expression and sporulation suggests that the S-layer provides a selective survival advantage within the host, which contributes to disease severity.

Farm animals have been identified as reservoirs of Clostridium difficile PCR-ribotype 078 (RT078). Since 2005, the incidence of human clinical cases (frequently severe), with this genotype has increased. We aimed to understand this change, by studying the recent evolutionary history of RT078. Phylogenetic analysis of international genomes (isolates from 2006-2014) revealed several recent clonal expansions. A common ancestor of each expansion had independently acquired different alleles of the tetracycline resistance gene tetM. Consequently, an unusually high proportion of RT078 genomes were tetM positive (76.5%). Additional tetracycline resistance determinants were also identified, some for the first time in C. difficile (efflux pump tet40). Each tetM-clonal expansion lacked geographic structure, indicating rapid international spread. Resistance determinants for C. difficile-infection-triggering antimicrobials including fluoroquinolones and clindamycin were comparatively rare in RT078. Tetracyclines are used intensively in agriculture; this selective pressure, plus rapid spread via the food-chain may explain the increased RT078 prevalence in humans.

Abstract Clostridioides difficile is a leading cause of human antibiotic-associated diarrhoeal disease globally. Zoonotic reservoirs of infection are increasingly suspected to play a role in the emergence of this disease in the community and dogs are considered as one potential source. Here we use a canine case-control study at a referral veterinary hospital in Scotland to assess: i) the risk factors associated with carriage of C. difficile by dogs, ii) whether carriage of C. difficile is associated with clinical disease in dogs and iii) the similarity of strains isolated from dogs with local human clinical surveillance. The overall prevalence of C. difficile carriage in dogs was 18.7% (95% CI 14.8-23.2%, n=61/327) of which 36% (n=22/61) were toxigenic strains. We found risk factors related to prior antibiotic treatment were significantly associated with C. difficile carriage by dogs. However, the presence of toxigenic strains of C. difficile in a canine faecal sample was not associated with diarrhoeal disease in dogs. Active toxin was infrequently detected in canine faecal samples carrying toxigenic strains (2/11 samples). Both dogs in which active toxin was detected had no clinical evidence of gastrointestinal disease. Among the ten toxigenic ribotypes of C. difficile detected in dogs in this study, six of these (012, 014, 020, 026, 078, 106) were ribotypes commonly associated with human clinical disease in Scotland, while atoxigenic isolates largely belonged to 010 and 039 ribotypes. Whilst C. difficile does not appear commonly associated with diarrhoeal disease in dogs, antibiotic treatment increases carriage of this bacteria including toxigenic strains commonly found in human clinical disease.