A major cause of the paucity of new starting points for drug discovery is the lack of interaction between academia and industry. Much of the global resource in biology is present in universities, whereas the focus of medicinal chemistry is still largely within industry. Open source drug discovery, with sharing of information, is clearly a first step towards overcoming this gap. But the interface could especially be bridged through a scale-up of open sharing of physical compounds, which would accelerate the finding of new starting points for drug discovery. The Medicines for Malaria Venture Malaria Box is a collection of over 400 compounds representing families of structures identified in phenotypic screens of pharmaceutical and academic libraries against the Plasmodium falciparum malaria parasite. The set has now been distributed to almost 200 research groups globally in the last two years, with the only stipulation that information from the screens is deposited in the public domain. This paper reports for the first time on 236 screens that have been carried out against the Malaria Box and compares these results with 55 assays that were previously published, in a format that allows a meta-analysis of the combined dataset. The combined biochemical and cellular assays presented here suggest mechanisms of action for 135 (34%) of the compounds active in killing multiple life-cycle stages of the malaria parasite, including asexual blood, liver, gametocyte, gametes and insect ookinete stages. In addition, many compounds demonstrated activity against other pathogens, showing hits in assays with 16 protozoa, 7 helminths, 9 bacterial and mycobacterial species, the dengue fever mosquito vector, and the NCI60 human cancer cell line panel of 60 human tumor cell lines. Toxicological, pharmacokinetic and metabolic properties were collected on all the compounds, assisting in the selection of the most promising candidates for murine proof-of-concept experiments and medicinal chemistry programs. The data for all of these assays are presented and analyzed to show how outstanding leads for many indications can be selected. These results reveal the immense potential for translating the dispersed expertise in biological assays involving human pathogens into drug discovery starting points, by providing open access to new families of molecules, and emphasize how a small additional investment made to help acquire and distribute compounds, and sharing the data, can catalyze drug discovery for dozens of different indications. Another lesson is that when multiple screens from different groups are run on the same library, results can be integrated quickly to select the most valuable starting points for subsequent medicinal chemistry efforts.

Abstract The human malaria parasite Plasmodium falciparum is globally widespread, but its prevalence varies significantly between and even within countries. Most population genetic studies in P. falciparum focus on regions of high transmission where parasite populations are large and genetically diverse, such as sub-Saharan Africa. Understanding population dynamics in low transmission settings, however, is of particular importance as these are often where drug resistance first evolves. Here, we use the Pacific Coast of Colombia and Ecuador as a model for understanding the population structure and evolution of Plasmodium parasites in small populations harboring low genetic diversity. The combination of low transmission and a high proportion of monoclonal infections means there are few outcrossing events and clonal lineages persist for long periods of time. Yet despite this, the population is evolutionarily labile and has successfully adapted to multiple drug regimes. Using 166 newly sequenced whole genomes, we measure relatedness between parasites, calculated as identity by descent (IBD), and find 17 distinct but highly related clonal lineages, six of which have persisted in the region for at least a decade. This inbred population structure is captured in more detail with IBD than with other common population structure analyses like PCA, ADMIXTURE, and distance-based trees. We additionally use patterns of intra-chromosomal IBD and an analysis of haplotypic variation to explore the role of recombination in spreading drug resistance mutations throughout the region. Two genes associated with chloroquine resistance, crt and aat1 , show evidence of hard selective sweeps, while selection appears soft and/or incomplete at three other key resistance loci ( dhps , mdr1 , and dhfr ). Overall, this work highlights the strength of IBD analyses for studying parasite population structure and resistance evolution in regions of low transmission, and emphasizes that drug resistance can evolve and spread in extremely small populations, as will occur in any region nearing malaria elimination.

To capture the transcriptional dynamics within proliferating cells, methods to differentiate nascent transcription from preexisting mRNAs are desired. One approach is to label newly synthesized mRNA transcripts in vivo through the incorporation of modified pyrimidines. However, the human malaria parasite, Plasmodium falciparum, is incapable of pyrimidine salvage for mRNA biogenesis. To capture cellular mRNA dynamics during Plasmodium development, we have engineered parasites that can salvage pyrimidines through the expression of a single bifunctional yeast fusion gene, cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase (FCU). We show that expression of FCU allows for the direct incorporation of thiol-modified pyrimidines into nascent mRNAs. Using developmental stage-specific promoters to express FCU-GFP enables the biosynthetic capture and in-depth analysis of mRNA dynamics from subpopulations of cells undergoing differentiation. We demonstrate the utility of this method by examining the transcriptional dynamics of the sexual gametocyte stage transition, a process that is essential to malaria transmission between hosts. We find that sexual stage commitment is governed by transcriptional reprogramming and the stabilization of a subset of essential gametocyte transcripts. This new method for biosynthetic labeling of Plasmodium mRNAs is incredibly versatile and can be used to measure transcriptional dynamics at any stage of parasite development, and thiol-modified RNAs will allow for future applications to measure RNA-protein interactions in the malaria parasite.

Abstract The repeated emergence of antimalarial drug resistance in Plasmodium falciparum , including to the current frontline antimalarial artemisinin, is a perennial problem for malaria control. Nextgeneration sequencing has greatly accelerated the identification of polymorphisms in resistance-associated genes, but has also highlighted the need for more sensitive and accurate laboratory tools to profile current and future antimalarials, and to quantify the impact of drug resistance acquisition on parasite fitness. The interplay of fitness and drug response is of fundamental importance in understanding why particular genetic backgrounds are better at driving the evolution of drug resistance in natural populations, but the impact of parasite fitness landscapes on the epidemiology of drug resistance has typically been laborious to accurately quantify in the lab, with assays being limited in accuracy and throughput. Here we present a scalable method to profile fitness and drug response of genetically distinct P. falciparum strains with well-described sensitivities to several antimalarials. We leverage CRISPR/Cas9 genome-editing and barcode sequencing to track unique barcodes integrated into a non-essential gene ( pfrh3 ). We validate this approach in multiplex competitive growth assays of three strains with distinct geographical origins. Furthermore, we demonstrate that this method can be a powerful approach for tracking artemisinin response as it can identify an artemisinin resistant strain within a mix of multiple parasite lines, suggesting an approach for scaling the laborious ring-stage survival assay (RSA) across libraries of barcoded parasite lines. Overall, we present a novel high-throughput method for multiplexed competitive growth assays to evaluate parasite fitness and drug response

The recurrent emergence of drug resistance in Plasmodium falciparum increases the urgency to genetically validate drug resistance mechanisms and identify new targets. Reverse genetics have facilitated genome-scale knockout screens in Plasmodium berghei and Toxoplasma gondii , in which pooled transfections of multiple vectors were critical to increasing scale and throughput. These approaches have not yet been implemented in P. falciparum , mainly because the extent to which pooled transfections can be performed in this species still remains unknown. Here we use next-generation sequencing to quantitate uptake of a pool of 94 barcoded vectors. The distribution of vectors in different transfections allowed us to estimate the number of barcodes and DNA molecules taken up by the parasite population. Dilution cloning showed that single transfected parasites routinely carry as many as seven episomal barcodes, revealing an intake of multiple vectors in a highly non-uniform fashion. Transfection of non-overlapping fluorescent proteins, which allowed us to follow the dynamics of the process, confirmed the tendency for parasites to take up multiple vectors from the early stages of transfection. This finding has important implications for how reverse genetics can be scaled in P. falciparum .

Malaria has had a major effect on the human genome, with many protective polymorphisms such as sickle cell trait having been selected to high frequencies in malaria endemic regions. Recently, we showed that a novel blood group variant, Dantu, provides 74% protection against all forms of severe malaria in homozygous individuals. This is a similar degree of protection to sickle cell trait and considerably greater than the most advanced malaria vaccine, but until now the mechanism of protection has been unknown. In the current study, we demonstrate a significant impact of Dantu on the ability of Plasmodium falciparum merozoites to invade RBCs. The Dantu variant was associated with extensive changes to the RBC surface protein repertoire, but unexpectedly the malaria protective effect did not correlate with specific RBC-parasite receptor-ligand interactions. By following invasion using video microscopy, we found a strong link between RBC tension and parasite invasion and, even in non-Dantu RBCs, identified a tension threshold above which RBC invasion did not occur. Dantu RBCs had higher average tension, meaning that a higher proportion of Dantu RBCs could not be invaded. These findings not only provide an explanation for the protective effect of Dantu against severe malaria, but also provide fresh insights into the essential process of P. falciparum parasite invasion, and how invasion efficiency varies across the heterogenous populations of RBCs that are present both within and between individuals.