Background The JAK2V617F allele has recently been identified in patients with polycythemia vera (PV), essential thrombocytosis (ET), and myelofibrosis with myeloid metaplasia (MF). Subsequent analysis has shown that constitutive activation of the JAK-STAT signal transduction pathway is an important pathogenetic event in these patients, and that enzymatic inhibition of JAK2V617F may be of therapeutic benefit in this context. However, a significant proportion of patients with ET or MF are JAK2V617F-negative. We hypothesized that activation of the JAK-STAT pathway might also occur as a consequence of activating mutations in certain hematopoietic-specific cytokine receptors, including the erythropoietin receptor (EPOR), the thrombopoietin receptor (MPL), or the granulocyte-colony stimulating factor receptor (GCSFR). Methods and Findings DNA sequence analysis of the exons encoding the transmembrane and juxtamembrane domains of EPOR, MPL, and GCSFR, and comparison with germline DNA derived from buccal swabs, identified a somatic activating mutation in the transmembrane domain of MPL (W515L) in 9% (4/45) of JAKV617F-negative MF. Expression of MPLW515L in 32D, UT7, or Ba/F3 cells conferred cytokine-independent growth and thrombopoietin hypersensitivity, and resulted in constitutive phosphorylation of JAK2, STAT3, STAT5, AKT, and ERK. Furthermore, a small molecule JAK kinase inhibitor inhibited MPLW515L-mediated proliferation and JAK-STAT signaling in vitro. In a murine bone marrow transplant assay, expression of MPLW515L, but not wild-type MPL, resulted in a fully penetrant myeloproliferative disorder characterized by marked thrombocytosis (Plt count 1.9–4.0 × 1012/L), marked splenomegaly due to extramedullary hematopoiesis, and increased reticulin fibrosis. Conclusions Activation of JAK-STAT signaling via MPLW515L is an important pathogenetic event in patients with JAK2V617F-negative MF. The bone marrow transplant model of MPLW515L-mediated myeloproliferative disorders (MPD) exhibits certain features of human MF, including extramedullary hematopoiesis, splenomegaly, and megakaryocytic proliferation. Further analysis of positive and negative regulators of the JAK-STAT pathway is warranted in JAK2V617F-negative MPD.

An acquired somatic mutation, Jak2V617F, was recently discovered in most patients with polycythemia vera (PV), chronic idiopathic myelofibrosis (CIMF), and essential thrombocythemia (ET). To investigate the role of this mutation in vivo, we transplanted bone marrow (BM) transduced with a retrovirus expressing either Jak2 wild-type (wt) or Jak2V617F into lethally irradiated syngeneic recipient mice. Expression of Jak2V617F, but not Jak2wt, resulted in clinicopathologic features that closely resembled PV in humans. These included striking elevation in hemoglobin level/hematocrit, leukocytosis, megakaryocyte hyperplasia, extramedullary hematopoiesis resulting in splenomegaly, and reticulin fibrosis in the bone marrow. Histopathologic and flow cytometric analyses showed an increase in maturing myeloid lineage progenitors, although megakaryocytes showed decreased polyploidization and staining for acetylcholinesterase. In vitro analysis of primary cells showed constitutive activation of Stat5 and cytokine-independent growth of erythroid colony-forming unit (CFU-E) and erythropoietin hypersensitivity, and Southern blot analysis for retroviral integration indicated that the disease was oligoclonal. Furthermore, we observed strain-specific differences in phenotype, with Balb/c mice demonstrating markedly elevated leukocyte counts, splenomegaly, and reticulin fibrosis compared with C57Bl/6 mice. We conclude that Jak2V617F expression in bone marrow progenitors results in a PV-like syndrome with myelofibrosis and that there are strain-specific modifiers that may in part explain phenotypic pleiotropy of Jak2V617F-associated myeloproliferative disease in humans.

Stem-cell differentiation to desired lineages requires navigating alternating developmental paths that often lead to unwanted cell types. Hence, comprehensive developmental roadmaps are crucial to channel stem-cell differentiation toward desired fates. To this end, here, we map bifurcating lineage choices leading from pluripotency to 12 human mesodermal lineages, including bone, muscle, and heart. We defined the extrinsic signals controlling each binary lineage decision, enabling us to logically block differentiation toward unwanted fates and rapidly steer pluripotent stem cells toward 80%–99% pure human mesodermal lineages at most branchpoints. This strategy enabled the generation of human bone and heart progenitors that could engraft in respective in vivo models. Mapping stepwise chromatin and single-cell gene expression changes in mesoderm development uncovered somite segmentation, a previously unobservable human embryonic event transiently marked by HOPX expression. Collectively, this roadmap enables navigation of mesodermal development to produce transplantable human tissue progenitors and uncover developmental processes.Video AbstracteyJraWQiOiI4ZjUxYWNhY2IzYjhiNjNlNzFlYmIzYWFmYTU5NmZmYyIsImFsZyI6IlJTMjU2In0.eyJzdWIiOiJlNGRkYjk3Y2QzNjQzY2JjMmE5YTEzOTZkNWU5NjdjZSIsImtpZCI6IjhmNTFhY2FjYjNiOGI2M2U3MWViYjNhYWZhNTk2ZmZjIiwiZXhwIjoxNjc4NDQ4NDQ4fQ.e63EUWgSQ9qsR8Zzx5a1CPWLr9QxPN11ka15_JvjKOZqJdDJX0NtD1ENbMsTnFoeJD-0eI9cdMRs_Fx6sjMPvXu0GeAFY2rdPYKG5QKpzR93Vmkkurd0x0cxqV3aKDs_KOT73ZjN4KxnT16-1rZhD8vjOT5FkqRpnjwdIvmwWeFWdu3aBvcry4FQ8g45v-sJNOWN4DaXyQ6xeLumByi-73XMed3j94sXJ9w9PfvlXAWbiNhlPPD0nTs7asVwYV5YrDOQEP8g0sj1TlWT4v2oQyOTbXLGZWrBzxhJVFUYe8VL5Z1djlqu_n2gYDE3JmxIH8FsK8WQ4KfRKM_gb4rzRA(mp4, (63.77 MB) Download video

We report that TG101348, a selective small-molecule inhibitor of JAK2 with an in vitro IC50 of approximately 3 nM, shows therapeutic efficacy in a murine model of myeloproliferative disease induced by the JAK2V617F mutation. In treated animals, there was a statistically significant reduction in hematocrit and leukocyte count, a dose-dependent reduction/elimination of extramedullary hematopoiesis, and, at least in some instances, evidence for attenuation of myelofibrosis. There were no apparent toxicities and no effect on T cell number. In vivo responses were correlated with surrogate endpoints, including reduction/elimination of JAK2V617F disease burden assessed by quantitative genomic PCR, suppression of endogenous erythroid colony formation, and in vivo inhibition of JAK-STAT signal transduction as assessed by flow cytometric measurement of phosphorylated Stat5.

We report a Jak2V617F knockin mouse myeloproliferative neoplasm (MPN) model resembling human polycythemia vera (PV). The MPN is serially transplantable and we demonstrate that the hematopoietic stem cell (HSC) compartment has the unique capacity for disease initiation but does not have a significant selective competitive advantage over wild-type HSCs. In contrast, myeloid progenitor populations are expanded and skewed toward the erythroid lineage, but cannot transplant the disease. Treatment with a JAK2 kinase inhibitor ameliorated the MPN phenotype, but did not eliminate the disease-initiating population. These findings provide insights into the consequences of JAK2 activation on HSC differentiation and function and have the potential to inform therapeutic approaches to JAK2V617F-positive MPN.

Regeneration without scarring Wounds in adult mammals typically heal by forming fibrotic scars. Mascharak et al. found that a specific population of skin fibroblasts ( Engrailed-1 lineage–negative fibroblasts) activate expression of Engrailed-1 and turn on profibrotic cellular programs in response to local tissue mechanics in wounds (see the Perspective by Konieczny and Naik). When mechanical signaling was inhibited in these cells (using either genetic deletion or small-molecule inhibition), skin wounds in mice no longer formed scars but instead healed by regeneration, restoring skin with normal hair follicles and glands, extracellular matrix, and mechanical strength. Science , this issue p. eaba2374 ; see also p. 346

In the skin, tissue injury results in fibrosis in the form of scars composed of dense extracellular matrix deposited by fibroblasts. The therapeutic goal of regenerative wound healing has remained elusive in part because principles of fibroblast programming and adaptive response to injury remain incompletely understood. Here, we present a multimodal -omics platform for the comprehensive study of cell populations in complex tissue, which has allowed us to characterize the cells involved in wound healing across both time and space. We employ a stented wound model that recapitulates human tissue repair kinetics and multiple Rainbow transgenic lines to precisely track fibroblast fate during the physiologic response to injury. Through integrated analysis of single cell chromatin landscapes and gene expression states, coupled with spatial transcriptomic profiling, we are able to impute fibroblast epigenomes with temporospatial resolution. This has allowed us to define the mechanisms controlling cell fate during migration, proliferation, and differentiation following tissue injury and thereby reexamine the canonical phases of wound healing. These findings have broad implications for the study of tissue repair in complex organ systems.

Abstract Thrombopoietin (TPO) and the TPO-receptor (TPO-R, or c-MPL)) are essential for hematopoietic stem cell (HSC) maintenance and megakaryocyte differentiation. Agents that can modulate TPO-R signaling are highly desirable, both experimentally and clinically. We have developed a series of surrogate protein-ligands for TPO-R, in the form of diabodies, that homodimerize the TPO-R on the cell surface in different geometries, in effect ‘tuning’ downstream signaling responses. These surrogate ligands exhibit diverse pharmacological properties, inducing graded signaling outputs, from full to partial TPO agonism and antagonism, thus decoupling the dual functions of TPO/TPO-R. Using scRNA sequencing and HSC self-renewal assays we find that partial agonistic diabodies preserved the stem-like properties of cultured HSCs, but also blocked oncogenic colony formation in Essential Thrombocythemia (ET) through inverse agonism. Our data suggest that dampening downstream TPO signaling is a powerful approach not only for HSC preservation in culture, but also for inhibiting oncogenic signaling through the TPO-R. Significance Statement The TPO cytokine, which signals through its receptor c-MPL (or TPO-R), is essential for megakaryocyte differentiation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs). Its signaling is deregulated in Essential Thrombocythemia (ET). Here, we engineered diabodies (DBs) against the TPO-R as surrogate TPO ligands to manipulate TPO-R signaling, from full to partial to antagonism, thus decoupling the dual functions of TPO/TPO-R (i.e, HSC maintenance versus megakaryopoiesis). We subsequently discovered that partial agonistic DBs, by reducing the strength of the TPO-R signal, not only preserved HSCs in culture, but also blocked oncogenic signaling in ET. This finding has the potential to improve HSC cultures for transplants, as well as serve as a unique therapeutic approach for ET.

Abstract Scleroderma is a devastating fibrotic autoimmune disease. Current treatments are partly effective in preventing disease progression, but do not remove fibrotic tissue. Here, we evaluated whether scleroderma fibroblasts take advantage of the “don’t-eat-me-signal” CD47 and whether blocking CD47 enables the body’s immune system to get rid of diseased fibroblasts. To test this approach, we used a Jun -inducible scleroderma model. We first demonstrated in patient samples that scleroderma upregulated JUN and increased promotor accessibilities of both JUN and the CD47. Next, we established our scleroderma model demonstrating that Jun mediated skin fibrosis through the hedgehog-dependent expansion of CD26+Sca1-fibroblasts in mice. In a niche-independent adaptive transfer model, JUN steered graft survival and conferred increased self-renewal to fibroblasts. In vivo, JUN enhanced the expression of CD47, and inhibiting CD47 eliminated an ectopic fibroblast graft and increased in vitro phagocytosis. In the syngeneic mouse, depleting macrophages ameliorated skin fibrosis. Therapeutically, combined CD47 and IL6 blockade reversed skin fibrosis in mice and led to the rapid elimination of ectopically transplanted scleroderma cells. Altogether, our study is the first to demonstrate the efficiency of combining different immunotherapies in treating scleroderma and provide a rationale for combining CD47 and IL6 inhibition in clinical trials.