Cephalochordates, urochordates, and vertebrates evolved from a common ancestor over 520 million years ago. To improve our understanding of chordate evolution and the origin of vertebrates, we intensively searched for particular genes, gene families, and conserved noncoding elements in the sequenced genome of the cephalochordate Branchiostoma floridae , commonly called amphioxus or lancelets. Special attention was given to homeobox genes, opsin genes, genes involved in neural crest development, nuclear receptor genes, genes encoding components of the endocrine and immune systems, and conserved cis -regulatory enhancers. The amphioxus genome contains a basic set of chordate genes involved in development and cell signaling, including a fifteenth Hox gene. This set includes many genes that were co-opted in vertebrates for new roles in neural crest development and adaptive immunity. However, where amphioxus has a single gene, vertebrates often have two, three, or four paralogs derived from two whole-genome duplication events. In addition, several transcriptional enhancers are conserved between amphioxus and vertebrates—a very wide phylogenetic distance. In contrast, urochordate genomes have lost many genes, including a diversity of homeobox families and genes involved in steroid hormone function. The amphioxus genome also exhibits derived features, including duplications of opsins and genes proposed to function in innate immunity and endocrine systems. Our results indicate that the amphioxus genome is elemental to an understanding of the biology and evolution of nonchordate deuterostomes, invertebrate chordates, and vertebrates.

Abstract Chordates are divided into three subphyla: Vertebrata, Tunicata and Cephalochordata. Phylogenetically, the Cephalochordata, more commonly known as lancelets or amphioxus, constitute the sister group of Vertebrata and Tunicata. Lancelets are small, benthic, marine filter feeders, and their roughly three dozen described species are divided into three genera: Branchiostoma , Epigonichthys and Asymmetron . Due to their phylogenetic position and their stereotypical chordate morphology and genome architecture, lancelets are key models for understanding the evolutionary history of chordates. Lancelets have thus been studied by generations of scientists, with the first descriptions of adult anatomy and developmental morphology dating back to the 19 th century. Today, several different lancelet species are used as laboratory models, predominantly for developmental, molecular and genomic studies. Surprisingly, however, a universal staging system and an unambiguous nomenclature for developing lancelets have not yet been adopted by the scientific community. In this work, we characterized the development of the European amphioxus ( Branchiostoma lanceolatum ) using confocal microscopy and compiled a streamlined developmental staging system, from fertilization through larval life, including an unambiguous stage nomenclature. By tracing growth curves of the European amphioxus reared at different temperatures, we were able to show that our staging system permitted an easy conversion of any developmental time into a specific stage name. Furthermore, comparisons of embryos and larvae from the European lancelet ( B. lanceolatum ), the Florida lancelet ( B. floridae ), the Chinese lancelet ( B. belcheri ), the Japanese lancelet ( B. japonicum ) and the Bahamas lancelet ( Asymmetron lucayanum ) demonstrated that our staging system could readily be applied to other lancelet species. Although the detailed staging description was carried out on developing B. lanceolatum , the comparisons with other lancelet species thus strongly suggested that both staging and nomenclature are applicable to all extant lancelets. We conclude that this description of embryonic and larval development will be of great use for the scientific community and that it should be adopted as the new standard for defining and naming developing lancelets. More generally, we anticipate that this work will facilitate future studies comparing representatives from different chordate lineages.

Crinoids belong to the Echinodermata, marine invertebrates with a highly derived adult pentaradial body plan. As the sister group to all other extant echinoderms, crinoids occupy a key phylogenetic position to explore the evolutionary history of the whole phylum. However, their development remains understudied compared with that of other echinoderms. Therefore, the aim here was to establish the Mediterranean feather star ( Antedon mediterranea ) as an experimental system for developmental biology. We first set up a method for culturing embryos in vitro and defined a standardized staging system for this species. We then optimized protocols to characterize the morphological and molecular development of the main structures of the feather star body plan. Focusing on the nervous system, we showed that the larval apical organ includes serotonergic, GABAergic and glutamatergic neurons, which develop within a conserved anterior molecular signature. We described the composition of the early post-metamorphic nervous system and revealed that it has an anterior signature. These results further our knowledge on crinoid development and provide new techniques to investigate feather star embryogenesis. This will pave the way for the inclusion of crinoids in comparative studies addressing the origin of the echinoderm body plan and the evolutionary diversification of deuterostomes.

ABSTRACT Retinoic acid receptors (RARs) and retinoid X receptors (RXRs) form heterodimers that activate target gene transcription by recruiting co-activator complexes in response to ligand binding. The nuclear receptor (NR) co-activator TIF2 mediates this recruitment by interacting with the ligand-binding domain (LBD) of NRs trough the nuclear receptor interaction domain (TIF2 NRID ) containing three highly conserved α-helical LxxLL motifs (NR-boxes). The precise binding mode of this domain to RXR/RAR is not clear due to the disordered nature of TIF2. Here we present the structural characterization of TIF2 NRID by integrating several experimental (NMR, SAXS, CD, SEC-MALS) and computational data. Collectively, the data are in agreement with a largely disordered protein with partially structured regions, including the NR-boxes and their flanking regions, which are evolutionary conserved. NMR and X-ray crystallographic data on TIF2 NRID in complex with RXR/RAR reveal a cooperative binding of the three NR-boxes as well as an active role of their flanking regions in the interaction.

Abstract A model organism in developmental biology is defined by its experimental amenability as well as by resources created for the model system by the scientific community. For the most powerful models, the combination of both has already yielded a thorough understanding of development. However, the number of developmental model systems is still very limited, and their phylogenetic distribution is heavily biased. Members of one of the largest animal phyla, the mollusks, for example, have long been neglected as developmental model organisms. To remedy this shortcoming, we produced a detailed developmental transcriptome for the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis , a bivalve mollusk, and expanded the list of experimental protocols available for this species. Our high-quality transcriptome allowed us to identify transcriptomic signatures of developmental transitions and to perform a first comparison with the Pacific oyster Crassostrea gigas that can be used in future multi-species analyses. To allow co-labelling studies, we optimized protocols for immunohistochemistry and hybridization chain reaction and combined both techniques to create high-resolution co-expression maps of developmental genes. The resources and protocols we describe here thus represent an enormous boost for the establishment of the Mediterranean mussel as a laboratory model in developmental biology. Summary statement Resources and techniques are described for the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis , which, together, establish a novel model system for studying mollusk development and animal evolution.

Abstract Signaling pathways control a large number of gene regulatory networks (GRNs) during animal development, acting as major tools for body plan formation 1 . Remarkably, in contrast to the large number of transcription factors present in animal genomes, only a few of these pathways operate during development 2 . Moreover, most of them are largely conserved along metazoan evolution 3 . How evolution has generated a vast diversity of animal morphologies with such a limited number of tools is still largely unknown. Here we show that gain of interconnectivity between signaling pathways, and the GRNs they control, may have played a critical contribution to the origin of vertebrates. We perturbed the retinoic acid, Wnt, FGF and Nodal signaling pathways during gastrulation in amphioxus and zebrafish and comparatively examined its effects in gene expression and cis-regulatory elements (CREs). We found that multiple developmental genes gain response to these pathways through novel CREs in the vertebrate lineage. Moreover, in contrast to amphioxus, many of these CREs are highly interconnected and respond to multiple pathways in zebrafish. Furthermore, we found that vertebrate-specific cell types are more enriched in highly interconnected genes than those tissues with more ancestral origin. Thus, the increase of CREs in vertebrates integrating inputs from different signaling pathways probably contributed to gene expression complexity and the formation of new cell types and morphological novelties in this lineage.

Abstract Optimal cardiac function requires appropriate contractile proteins in each heart chamber. Atria require slow myosins to act as variable reservoirs, while ventricles demand fast myosin for swift pumping functions. Hence, myosin is under chamber-biased cis -regulatory control to achieve this functional distribution. Failure in proper regulation of myosin genes can lead to severe congenital heart dysfunction. The precise regulatory input leading to cardiac chamber-biased expression remains uncharted. To address this, we computationally and molecularly dissected the quail Slow Myosin Heavy Chain III (SMyHC III) promoter that drives specific gene expression to the atria to uncover the regulatory information leading to chamber expression and understand their evolutionary origins. We show that SMyHC III gene states are autonomously orchestrated by a complex nuclear receptor cis -regulatory element (cNRE), a 32- bp sequence with hexanucleotide binding repeats. Using in vivo transgenic assays in zebrafish and mouse models, we demonstrate that preferential atrial expression is achieved by the combinatorial regulatory input composed of atrial activation motifs and ventricular repression motifs. Through comparative genomics, we provide evidence that the cNRE emerged from an endogenous viral element, most likely through infection of an ancestral host germline. Our study reveals an evolutionary pathway to cardiac chamber-specific expression.

ABSTRACT In order to gain insight into the origin and mode of evolution of asymmetries in the vertebrate habenula, we have used combinations of transcriptomic and functional approaches in a cartilaginous fish, the catshark Scyliorhinus canicula . We find that catshark habenulae harbor marked asymmetries not only in the medial habenulae as in the zebrafish, but also in the lateral habenulae, which differ extensively by their neuronal identities. Comparisons across a broad sampling of gnathostomes suggest that the latter reflect an ancestral gnathostome trait, independently lost in tetrapods and neopterygians. Analysis of underlying mechanisms in the catshark highlight an asymmetric temporal control of neurogenesis in the medial habenulae and a central role of Wnt signaling in the elaboration of asymmetries in the lateral ones. The pathway is submitted to a highly dynamic, asymmetric regulation during habenula development, with a Nodal dependent left repression at a stage when precursors for lateral habenulae have exited cell cycles. Using a pharmacological approach during this time window, we show that Wnt activity promotes lateral right neuronal identities in the lateral right habenula, while its repression by Nodal in the lateral left habenula promotes lateral left neuronal identities. Based on comparisons of these data with those reported in the zebrafish and in the mouse, we propose that habenular asymmetry formation and diversification in gnathostomes rely on a same developmental logic, involving a conserved temporal regulation of neurogenesis, which shapes neuronal identities on both sides and is asymmetrically modified by a dynamic Wnt activity, right restricted in the ancestral state and prone to variations in time and space during evolution.