Abstract Many computer-aided design tools are available for synthetic biology and metabolic engineering. Yet, these tools can be difficult to apprehend, sometimes requiring a level of expertise that limits their use by a wider community. Furthermore, some of the tools, although complementary, rely on different input and output formats and cannot communicate with one another. Scientific workflows address these shortcomings while offering a novel design strategy. Among the workflow systems available, Galaxy is a web-based platform for performing findable and accessible data analyses for all scientists regardless of their informatics expertise, along with interoperable and reproducible computations regardless of the particular platform that is being used. Here, we introduce the Galaxy-SynBioCAD a portal, the first Galaxy toolshed for synthetic biology and metabolic engineering. It allows one to easily create workflows or use those already developed by the community. The portal is a growing community effort where developers can add new tools and users can evaluate the tools performing design for their specific projects. The tools and workflows currently shared on the Galaxy-SynBioCAD portal cover an end-to-end metabolic pathway design process from the selection of strain and target to the calculation of DNA parts to be assembled to build libraries of strains to be engineered to produce the target. Standard formats are used throughout to enforce the compatibility of the tools. These include SBML for strain and pathway and SBOL for genetic layouts. The portal has been benchmarked on 81 literature pathways, overall, we find we have a 65% (and 88%) success rate in retrieving the literature pathways among the top 10 (50) pathways predicted and generated by the workflows.

ABSTRACT The use of linear DNA templates in cell-free systems promises to accelerate the prototyping and engineering of synthetic gene circuits. A key challenge is that linear templates are rapidly degraded by exonucleases present in cell extracts. Current approaches tackle the problem by adding exonuclease inhibitors and DNA-binding proteins to protect the linear DNA, requiring additional time- and resource-intensive steps. Here, we delete the recBCD exonuclease gene cluster from the Escherichia coli BL21 genome. We show that the resulting cell-free systems, with buffers optimized specifically for linear DNA, enable near-plasmid levels of expression from σ70 promoters in linear DNA templates without employing additional protection strategies. When using linear or plasmid DNA templates at the buffer calibration step, the optimal potassium glutamate concentrations obtained when using linear DNA were consistently lower than those obtained when using plasmid DNA for the same extract. We demonstrate the robustness of the exonuclease deficient extracts across seven different batches and a wide range of experimental conditions across two different laboratories. Finally, we illustrate the use of the Δ recBCD extracts for two applications: toehold switch characterization and enzyme screening. Our work provides a simple, efficient, and cost-effective solution for using linear DNA templates in cell-free systems and highlights the importance of specifically tailoring buffer composition for the final experimental setup. Our data also suggest that similar exonuclease deletion strategies can be applied to other species suitable for cell-free synthetic biology.

ABSTRACT Cell-free systems have great potential for delivering robust, cheap, and field-deployable biosensors. Many cell-free biosensors rely on transcription factors responding to small molecules, but their discovery and implementation still remain challenging. Here we report the engineering of PeroxiHUB, an optimized H 2 O 2 -centered sensing platform supporting cell-free detection of different metabolites. H 2 O 2 is a central metabolite and a by-product of numerous enzymatic reactions. PeroxiHUB uses enzymatic transducers to convert metabolites of interest into H 2 O 2 , enabling rapid reprogramming of sensor specificity using alternative transducers. We first screen several transcription factors and optimize OxyR for the transcriptional response to H 2 O 2 in cell-free, highlighting the need for pre-incubation steps to obtain suitable signal-to-noise ratios. We then demonstrate modular detection of metabolites of clinical interest – lactate, sarcosine, and choline – using different transducers mined via a custom retro-synthesis workflow publicly available on the SynBioCAD Galaxy portal. We find that expressing the transducer during the pre-incubation step is crucial for optimal sensor operation. Finally, we show that different reporters can be connected to PeroxiHUB, providing high adaptability for various applications. Given the wide range of enzymatic reactions producing H 2 O 2 , the PeroxiHUB platform will support cell-free detection of a large number of metabolites in a modular and scalable fashion.

Lysate-based cell-free systems have become a major platform to study gene expression but batch-to-batch variation makes protein production difficult to predict. Here we describe an active learning approach to explore a combinatorial space of ~4,000,000 cell-free compositions, maximizing protein production and identifying critical parameters involved in cell-free productivity. We also provide a one-step-method to achieve high quality predictions for protein production using minimal experimental effort regardless of the lysate quality.

Synthetic biological circuits are promising tools for developing sophisticated systems for medical, industrial, and environmental applications. So far, circuit implementations commonly rely on gene expression regulation for information processing using digital logic. Here, we present a new approach for biological computation through metabolic circuits designed by computer-aided tools, implemented in both whole-cell and cell-free systems. We first combine metabolic transducers to build an analog adder, a device that sums up the concentrations of multiple input metabolites. Next, we build a weighted adder where the contributions of the different metabolites to the sum can be adjusted. Using a computational model trained on experimental data, we finally implement two four-input perceptrons for desired binary classification of metabolite combinations by applying model-predicted weights to the metabolic perceptron. The perceptron-mediated neural computing introduced here lays the groundwork for more advanced metabolic circuits for rapid and scalable multiplex sensing.