ABSTRACT Isolation and characterization of antibodies in COVID-19 patients has largely focused on memory B cells, however it is the antibody-secreting plasma cells that are directly responsible for the production of serum antibodies, which play a critical role in controlling and resolving SARS-CoV-2 infection. To date there is little known about the specificity of plasma cells in COVID-19 patients. This is largely because plasma cells lack surface antibody expression, which complicates their screening. Here, we describe a technology pipeline that integrates single-cell antibody repertoire sequencing and high-throughput mammalian display screening to interrogate the specificity of plasma cells from 16 convalescent COVID-19 patients. Single-cell sequencing allows us to profile antibody repertoire features in these patients and identify highly expanded clonal lineages. Mammalian display screening is employed to reveal that 37 antibodies (out of 132 candidates) derived from expanded plasma cell clonal lineages are specific for SARS-CoV-2 antigens, including antibodies that target the receptor binding domain (RBD) with high affinity and exhibit potent neutralization of SARS-CoV-2. One Sentence Summary Single-cell antibody repertoire sequencing and high-throughput screening identifies highly expanded plasma cells from convalescent COVID-19 patients that produce SARS-CoV-2-specific antibodies capable of potent neutralization.

ABSTRACT T cell receptor (TCR) gene therapy is a promising cell therapy approach for the treatment of cancer. However, most naturally occurring TCRs display low affinities to their peptide-MHC targets, and engineering of TCRs for enhanced affinity is complicated by the risk of introducing cross-reactivity and the poor correlation between affinity and function. Here we report the establishment of the TCR-accepting T cell (TnT) platform through five sequential CRISPR-Cas9 genome editing steps of a human T cell line, and demonstrate its application for functional engineering of TCRs and prediction of cross-reactivity. Using the TnT platform, we profile the mutational landscapes of tumor-specific TCRs at high-throughput to reveal a substantial discordance between antigen binding and antigen-induced signaling. Furthermore, we combine CRISPR-targeting, functional selection and deep sequencing to screen TCR mutagenesis libraries and identify variants with enhanced recognition of the cancer-testis antigen MAGE-A3. Finally, functional cross-reactivity profiling using TnT cells was able to accurately predict off-targets and identify engineered TCRs with exquisite specificity to MAGE-A3. Thus, the TnT platform represents a valuable technology for the engineering of TCRs with enhanced functional and safety profiles.

Abstract COVID-19 disease outcome is highly dependent on adaptive immunity from T and B lymphocytes, which play a critical role in the control, clearance and long-term protection against SARS-CoV-2. To date, there is limited knowledge on the composition of the T and B cell immune receptor repertoires [T cell receptors (TCRs) and B cell receptors (BCRs)] and transcriptomes in convalescent COVID-19 patients of different age groups. Here, we utilize single-cell sequencing (scSeq) of lymphocyte immune repertoires and transcriptomes to quantitatively profile the adaptive immune response in COVID-19 patients of varying age. We discovered highly expanded T and B cells in multiple patients, with the most expanded clonotypes coming from the effector CD8 + T cell population. Highly expanded CD8 + and CD4 + T cell clones show elevated markers of cytotoxicity (CD8: PRF1, GZMH, GNLY; CD4: GZMA), whereas clonally expanded B cells show markers of transition into the plasma cell state and activation across patients. By comparing young and old convalescent COVID-19 patients (mean ages = 31 and 66.8 years, respectively), we found that clonally expanded B cells in young patients were predominantly of the IgA isotype and their BCRs had incurred higher levels of somatic hypermutation than elderly patients. In conclusion, our scSeq analysis defines the adaptive immune repertoire and transcriptome in convalescent COVID-19 patients and shows important age-related differences implicated in immunity against SARS-CoV-2.

Adoptive transfer of autologous tumor-infiltrating lymphocyte T cells (TILs) offers one of the most promising approaches for cancer immunotherapy. However, high variability in patient responses highlight the need for an enhanced understanding of the transcriptional phenotypes of TILs and reactivity of their T cell receptors (TCR). Here, we employ single-cell multiomics approaches and TCR functional screening to investigate TILs from treatment-naive non-small cell lung cancer patients. This comprehensive analysis integrates scRNA-seq, scTCR-seq, and scATAC-seq, enabling a high-resolution examination of TILs within lung cancer tissue, as well as the adjacent non-tumor tissue. We apply a cellular functional screening platform to identify reactive TCRs that represent >1,000 TILs and have specificity towards a multitude of targets, including primary tumor cells, neoantigens, tumor-associated antigens, and viral antigens. Tumor-reactive TILs were primarily associated with dysfunctional phenotypes, whereas viral antigen-reactive TCRs were found in effector phenotype clusters. Key marker genes were identified and used to construct a tumor or viral reactivity score. Comparing clones shared in tumor and non-tumor tissue, a higher fraction of exhausted cells was observed in the tumor tissue, whereas non-tumor adjacent tissue possessed more effector cells, thus providing insight into potential sources for therapeutic T cells. Elucidating the specific T cell populations within TILs and their associated TCRs may support strategies to enhance the efficacy of TIL-based therapies.

ABSTRACT Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have advanced substantially in the clinic for cancer immunotherapy. However, challenges related to safety persist; one major concern is when CARs respond to antigen present on healthy cells (on-target, off-tumour response). A strategy to ameliorate this consists in engineering the affinity of CARs such that they are only activated by tumor cells expressing high antigen levels. Here, we developed a CAR T cell display platform for functional screening based on cell signaling. Starting with a CAR with high affinity towards its target antigen, we used CRISPR-Cas9 genome editing to generate a library of antigen-binding domain variants. Following multiple rounds of functional screening and deep sequencing-guided selection, CAR variants were identified that were discriminatively activated by tumor cells based on antigen expression levels. Our platform demonstrates how directed evolution based on functional screening can be used to enhance the selectivity and safety of CARs.

Abstract High-throughput single-cell sequencing (scSeq) technologies are revolutionizing the ability to molecularly profile B and T lymphocytes by offering the opportunity to simultaneously obtain information on adaptive immune receptor repertoires (VDJ repertoires) and transcriptomes. An integrated quantification of immune repertoire parameters such as germline gene usage, clonal expansion, somatic hypermutation and transcriptional states opens up new possibilities for the high-resolution analysis of lymphocytes and the inference of antigen-specificity. While multiple tools now exist to investigate gene expression profiles from scSeq of transcriptomes, there is a lack of software dedicated to single-cell immune repertoires. Here, we present Platypus, an open-source software platform providing a user-friendly interface to investigate B cell receptor (BCR) and T cell receptor (TCR) repertoires from single-cell sequencing experiments. Platypus provides a framework to automate and ease the analysis of single-cell immune repertoires while also incorporating transcriptional information involving unsupervised clustering, gene expression, and gene ontology. To showcase the capabilities of Platypus, we use it to analyze and visualize single-cell immune repertoires and transcriptomes from B and T cells from convalescent COVID-19 patients, revealing unique insight into the repertoire features and transcriptional profiles of clonally expanded lymphocytes. Platypus will expedite progress by increasing accessibility to the broader immunology community by facilitating the analysis of single-cell immune repertoire and transcriptome sequencing.