1 Summary Gene regulation involves synergistic interactions between transcription factors (TFs). Classical thermodynamic models offer a biophysical understanding of synergy based on binding cooperativity and regulated recruitment of RNA polymerase. However, transcription requires polymerase to transition through multiple states. Accordingly, recent work has suggested that ”kinetic synergy” can arise through TFs differentially regulating distinct steps of the transcription cycle. Disentangling both sources of synergy has been challenging. Here, we combine theory and experiment to analyze TFs binding to a single shared site, thereby removing simultaneous specific DNA binding. Using the graph-based linear framework, we integrate TF binding with regulation of the transcription cycle, and reveal a complex kinetic synergy landscape dependent on TF concentration, DNA binding and transcriptional activity. We exploit synthetic zinc-finger TF fusions to experimentally interrogate these predictions. Our results confirm that transcription cycle regulation must be integrated with recruitment for a quantitative understanding of transcriptional control.

DNA-binding proteins control many fundamental biological processes such as transcription, recombination and replication. A major goal is to decipher the role that DNA sequence plays in orchestrating the binding and activity of such regulatory proteins. To address this goal, it is useful to rationally design DNA sequences with desired numbers, affinities and arrangements of protein binding sites. However, removing binding sites from DNA is computationally non-trivial since one risks creating new sites in the process of deleting or moving others. Here we present an online binding site removal tool, SiteOut, that enables users to design arbitrary DNA sequences that entirely lack binding sites for factors of interest. SiteOut can also be used to delete sites from a specific sequence, or to introduce site-free spacers between functional sequences without creating new sites at the junctions. In combination with commercial DNA synthesis services, SiteOut provides a powerful and flexible platform for synthetic projects that interrogate regulatory DNA. Here we describe the algorithm and illustrate the ways in which SiteOut can be used; it is publicly available at https://depace.med.harvard.edu/siteout/

Combinatorial regulation of gene expression by multiple transcription factors (TFs) enables cells to carry out sophisticated computations that are key to cellular decision-making. How is the information contained in multiple TF binding sites integrated to dictate the rate of transcription? The dominant model is that direct or indirect physical interactions between TFs enable them to combinatorially recruit each other and RNA polymerase to the promoter. Here we develop a quantitative framework to explore an alternative model, where combinatorial gene regulation can result from TFs working on different kinetic steps of the transcription cycle. Our results clarify the null hypotheses for independent action of TFs and show that combinatorial control of the transcription cycle can generate a wide range of analog and Boolean computations without requiring the input regulators to be simultaneously co-localized in the nucleus. This work emphasizes the importance of deciphering TF function beyond activation and repression, highlights the role of the basal promoter in processing regulatory information and suggests qualitative explanations for the flexibility of regulatory evolution.

SUMMARY Transcription of developmental genes is controlled by multiple enhancers. Frequently, more than one enhancer can activate transcription from the same promoter in the same cells. In these cases, how is regulatory information from multiple enhancers combined to determine the overall expression output of their shared promoter? To investigate this question, we quantified nascent transcription driven by a pair shadow enhancers, each individual of the pair, and their duplications in Drosophila embryos using live imaging. This set of constructs allows us to quantify the “computation” made by the pairs of enhancers: their combined output expression as a function of the expression that they drive separately. We show that the computation performed by these shadow enhancers and duplications varies across the expression pattern, implying that how their activities are combined depends on the transcriptional regulators bound to the enhancers in different parts of the embryo. Characterizing the computation made by multiple enhancers is a critical first step in developing conceptual and computational models of gene expression at the locus level, where multiple enhancers collaborate.