Single-cell transcriptomic studies that require intracellular protein staining, rare cell sorting, or inactivation of infectious pathogens are severely limited because current high-throughput RNA sequencing methods are incompatible with paraformaldehyde treatment, a common tissue and cell fixation and preservation technique. Here we present FD-seq, a high-throughput method for droplet-based RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed, stained and sorted single-cells. We show that FD-seq preserves the mRNA integrity and relative abundances during fixation and subsequent cell retrieval. Furthermore, FD-seq detects a higher number of genes and transcripts than methanol fixation. We applied FD-seq to investigate two important questions in Virology. First, by analyzing a rare population of cells supporting lytic reactivation of the human tumor virus KSHV, we identified TMEM119 as a host factor that mediates viral reactivation. Second, we found that upon infection with the betacoronavirus OC43, which causes the common cold and is a close relative of SARS-CoV-2, pro-inflammatory pathways are primarily upregulated in lowly-infected cells that are exposed to the virus but fail to express high levels of viral genes. FD-seq thus enables integrating phenotypic with transcriptomic information in rare cell populations, and preserving and inactivating pathogenic samples that cannot be handled under regular biosafety measures.

Multiplexed analysis of single-cells enables accurate modeling of cellular behaviors, classification of new cell types, and characterization of their functional states. Here we present proximity-sequencing (Prox-seq), a method for simultaneous measurement of an individual cell’s proteins, protein complexes and mRNA. Prox-seq utilizes deep sequencing and barcoded proximity assays to measure proteins and their complexes from all pairwise combinations of targeted proteins, in thousands of single-cells. The number of measured protein complexes scales quadratically with the number of targeted proteins, providing unparalleled multiplexing capacity. We developed a high-throughput experimental and computational pipeline and demonstrated the potential of Prox-Seq for multi-omic analysis with a panel of 13 barcoded proximity probes, enabling the measurement of 91 protein complexes, along with thousands of mRNA molecules in single T-cells and B-cells. Prox-seq provides access to an untapped yet powerful measurement modality for single-cell phenotyping and can discover new protein interactions in signaling and drug studies.

Abstract Proximity sequencing (Prox-seq) measures gene expression, protein expression, and protein complexes at the single cell level, using information from dual-antibody binding events and a single cell sequencing readout. Prox-seq provides multi-dimensional phenotyping of single cells and was recently used to track the formation of receptor complexes during inflammatory signaling in macrophages and to discover a new interaction between CD9/CD8 proteins on naïve T cells. The distribution of protein abundance affects identification of protein complexes in a complicated manner in dual-binding assays like Prox-seq. These effects are difficult to explore with experiments, yet important for accurate quantification of protein complexes. Here, we introduce a physical model for protein dimer formation on single cells and computationally evaluate several different methods for reducing background noise when quantifying protein complexes. Furthermore, we developed an improved method for analysis of Prox-seq single-cell data, which resulted in more accurate and robust quantification of protein complexes. Finally, our model offers a simple way to investigate the behavior of Prox-seq under various biological conditions and guide users toward selecting the best analysis method for their data.

Abstract Coronavirus disease 2019 (COVID-19) poses significant risks for solid organ transplant recipients, who have atypical but poorly characterized immune responses to infection. We aim to understand the host immunologic and microbial features of COVID-19 in transplant recipients by leveraging a prospective multicenter cohort of 86 transplant recipients age- and sex-matched with 172 non-transplant controls. We find that transplant recipients have higher nasal SARS-CoV-2 viral abundance and impaired viral clearance, and lower anti-spike IgG levels. In addition, transplant recipients exhibit decreased plasmablasts and transitional B cells, and increased senescent T cells. Blood and nasal transcriptional profiling demonstrate unexpected upregulation of innate immune signaling pathways and increased levels of several proinflammatory serum chemokines. Severe disease in transplant recipients, however, is characterized by a less robust induction of pro-inflammatory genes and chemokines. Together, our study reveals distinct immune features and altered viral dynamics in solid organ transplant recipients.