Immunotherapy with chimeric antigen receptor (CAR)-expressing T cells that target the disialoganglioside GD2 expressed on tumor cells may be a therapeutic option for patients with high-risk neuroblastoma.In an academic, phase 1-2 clinical trial, we enrolled patients (1 to 25 years of age) with relapsed or refractory, high-risk neuroblastoma in order to test autologous, third-generation GD2-CAR T cells expressing the inducible caspase 9 suicide gene (GD2-CART01).A total of 27 children with heavily pretreated neuroblastoma (12 with refractory disease, 14 with relapsed disease, and 1 with a complete response at the end of first-line therapy) were enrolled and received GD2-CART01. No failure to generate GD2-CART01 was observed. Three dose levels were tested (3-, 6-, and 10×106 CAR-positive T cells per kilogram of body weight) in the phase 1 portion of the trial, and no dose-limiting toxic effects were recorded; the recommended dose for the phase 2 portion of the trial was 10×106 CAR-positive T cells per kilogram. Cytokine release syndrome occurred in 20 of 27 patients (74%) and was mild in 19 of 20 (95%). In 1 patient, the suicide gene was activated, with rapid elimination of GD2-CART01. GD2-targeted CAR T cells expanded in vivo and were detectable in peripheral blood in 26 of 27 patients up to 30 months after infusion (median persistence, 3 months; range, 1 to 30). Seventeen children had a response to the treatment (overall response, 63%); 9 patients had a complete response, and 8 had a partial response. Among the patients who received the recommended dose, the 3-year overall survival and event-free survival were 60% and 36%, respectively.The use of GD2-CART01 was feasible and safe in treating high-risk neuroblastoma. Treatment-related toxic effects developed, and the activation of the suicide gene controlled side effects. GD2-CART01 may have a sustained antitumor effect. (Funded by the Italian Medicines Agency and others; ClinicalTrials.gov number, NCT03373097.).

ABSTRACT Paediatric high grade glioma and diffuse midline glioma (including DIPG) are comprised of multiple biological and clinical subgroups, the majority of which urgently require novel therapies. Patient-derived in vitro primary cell cultures represent potentially useful tools for mechanistic and preclinical investigation based upon their retention of key features of tumour subgroups under experimental conditions amenable to high-throughput approaches. We present 17 novel primary cultures derived from patients in London, Dublin and Belfast, and together with cultures established or shared from Barcelona, Brisbane, Rome and Stanford, assembled a panel of 52 models under 2D (laminin matrix) and/or 3D (neurospheres) conditions, fully credentialed by phenotypic and molecular comparison to the original tumour sample (methylation BeadArray, panel/exome sequencing, RNAseq). In screening a subset of these against a panel of ~400 approved chemotherapeutics and small molecules, we identified specific dependencies associated with tumour subgroups and/or specific molecular markers. These included MYCN -amplified cells and ATM/DNA-PK inhibitors, and DIPGs with PPM1D activating truncating mutations and inhibitors of MDM2 or PARP1. Specific mutations in PDGFRA were found to confer sensitivity to a range of RTK inhibitors, though not all such mutations conferred sensitivity to targeted agents. Notably, dual PDGFRA/FGFR and downstream pathway MEK inhibitors showed profound effects against both PDGFRA-sensitising mutant and FGFR1-dependent non-brainstem pHGG and DIPG. In total, 85% cells were found to have at least one drug screening hit in short term assays linked to the underlying biology of the patient’s tumour, providing a rational approach for individualised clinical translation.

Abstract BACKGROUND Medulloblastoma (MB), the most frequent childhood brain tumor, originates in the cerebellum. Despite treatment advances, recurrence affects 40%, with a mortality rate of 30%. Cancer stem cells drive tumor initiation, maintenance, and therapy resistance, in several tumors including MB (MBSC). In response to stress, stem cells activate mechanisms like the unfolded protein response (UPR) to maintain homeostasis and survive adverse conditions. The UPR restores endoplasmic reticulum balance, supporting cell function and survival. Recent studies have shown that the UPR plays an important role in tumorigenesis, however, its function in MBSC remains unknown. METHODS To understand the involvement of the UPR in stem cell maintenance, we have investigated the biological effects of its pharmacological inhibition on Group 3 (G3) MBSC. We selected three G3 MB cell lines (D283-Med, D341-Med and Med411), for in vitro studies. Cell line selection was based on their fidelity to the expected methylation class, corresponding to the subgroup of the parental tumors, and were grown in “stem-like” conditions as neurospheres. We evaluated drugs targeting the UPR stress program, identifying ONC201 as the most effective against MBSC. ONC201 is an imipridone compound that activates p53-independent apoptosis causing changes in gene expression similar to those caused by UPR. RESULTS Our findings revealed that ONC201 modulates protein synthesis via ATF4, a pivotal UPR molecule, with stronger induction observed in MB cells cultured under “stem-like” conditions. This ATF4 upregulation triggers the activation of pro-apoptotic programs. Additionaly, ONC201 was effective on reducing the stem-like features of MBSC, including self-renewal, stem cell markers expression, migration, and invasion potential. Notably, ONC201 demonstrates synergy with vincristine and methotrexate chemotherapy. CONCLUSIONS These results propose ONC201 as a promising agent for targeting G3 medulloblastoma by compromising the stem cell compartment. Further investigation is warranted to confirm its efficacy and potential clinical application.

Abstract Paediatric-type diffuse high-grade gliomas (pDHGG) are a group of molecularly and clinically defined tumor entities of the central nervous system. The investigation of the spatial organization of pDHGG tissues may provide new insights to decipher their heterogeneous nature and identify vulnerabilities in their aggressive behaviour. Here we exploit Imaging Mass Cytometry (IMC), a spatial biology approach enabling multiplex tissue phenotyping at single-cell resolution. We used 16 total formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues from 4 patients including 1 Diffuse hemispheric glioma H3G34-mutant (DHG-H3G34), 1 Diffuse pediatric-type high-grade glioma H3-wildtype and IDH-wildtype (DHGG-WT) and 2 Diffuse midline glioma H3K27-altered (DMG-H3K27, 1 H3.3K27M and 1 H3.1K27M). Classical pathology assessment and DNA methylation profile were also performed. For IMC staining, 2 metal-tag custom-designed antibody panels (tumour and immune) of 31 antibodies were used. The panels include antibodies for differentiated and stem-cell markers, extracellular matrices, immune markers and H3K27M and H3.3G34R variants. An IMC analysis pipeline was developed: images are extracted in tiff format from the proprietary MCD files produced by Hyperion instrument, filtered to remove hot pixels via top-hat and OpenCV in Python, segmented using steinbock and analysed using the IMC Data Analysis toolbox in R, using docker. A total of 209 mm2 of tissue were analysed. IMC analysis showed that DHG-H3G34 displays a higher heterogeneity in terms of cell phenotypes compared to the other tumor entities. Moreover, immune infiltrate of T, B cells, NK and monocytes was observed in the DHG-H3G34 and DHGG-WT tissues, while the DMG-H3K27 had low/no immune infiltrate with the H3.3K27M showing higher PDL-1 expression. Analysis of longitudinal and multi-region samples highlighted trajectories of tumor evolution and identification of extracellular matrix niches in tumor core versus the infiltrative front. Our study provides novel insights into pDHGG complex biology by investigating their tissue architecture, spatial organization and cell-cell interactions.

Abstract BACKGROUND This trial evaluated feasibility,response,PFS/OS of a randomization comparing two different RT schedules for DIPG while administering the same systemic treatment. We moreover evaluated the benefit of craniospinal irradiation(CSI) in case of disseminated(D) relapse. METHODS Patients: 2-21 years-old with at least radiologically verified DIPG (MRI blindly reviewed at diagnosis,every 12 weeks thereafter) and symptoms duration below 6 months. Biopsy required if atypical imaging, also allowed after adequate consensus.Vinorelbine 20 mg/m2+nimotuzumab 150 mg/m2 were administered weekly for 12; thereafter every other week until tumor progression or for up to 2 years. Standard(ST) arm was full brainstem/focal tumor site RT at total dose of 54Gy(1.8Gy/day); for local progression re-irradiation was proposed at 19.8Gy, in case of dissemination CSI at 36Gy was offered.Experimental(SP) arm included three elective courses of RT at defined time-points(36Gy, 19.8Gy and 19.8Gy) with reirradiation for relapse at 9 Gy/36 Gy as above described. Incidences of local(L) and D progression were assessed in a competing risk setting. RESULTS 55 patients were included from 4 Italian centers,27 in ST,30 males, median age 7.1 years. Median follow-up 39.1 months. Fifteen patients needed a shunt,13 during treatment;23 were biopsied,in 21 according to local protocols.22/23 tumors had H3.3K27 mutation. 53 relapsed, 34 L,13 D,6 L+D.Fifteen/19 with a D component receiving CSI had a median survival of 7.6 months after relapse, significantly higher than that of the 4 without CSI(median 2.9 months,P=0.020). Patients submitted to biopsies had more D(P=0.017) and less L progression(P=0.058). SP irradiation and any reirradiation at relapse were feasible and never produced significant radionecrosis.Median EFS/OS for the whole series were 8.4/14 months, respectively; not significantly different between patients with local vs. disseminated relapses. CONCLUSIONS Reirradiation, even if CSI, confirmed feasible and benefitted patients OS.Randomization results will be later reported.

Abstract The association between pediatric high-grade gliomas (HGG) and cancer predisposition syndromes (CPS) remains inadequately elucidated in the existing literature, while next-generation sequencing (NGS) is increasingly utilized for diagnostic support. In this retrospective analysis, we evaluated a cohort of 95 consecutive pediatric patients with HGG reclassified according to the latest 2021 WHO classification, diagnosed and treated at the Bambino Gesù Children’s Hospital between 2011 and 2023. All patients underwent genetic germline testing with NGS technology to detect the presence of germline variants predisposing to cancer and were included in this study. Diagnosis of pHGG H3-IDH wild-type was performed in 23 patients (24.2%), diffuse midline glioma in 46 patients (48.4%), astrocytoma IDH-mutant in 7 patients (7.4%), anaplastic pleomorphic xanthoastrocytoma in 4 patients (4.2%), adult type HGG in 4 patients (4.2%), neuroepithelial tumor PATZ1 fusion-positive in 3 patients (3.2%), diffuse hemispheric glioma H3 G34-mutant in 2 patients (2.1%), infant-type hemisheric glioma in 2 patients (2.1%), other rare histologies in 4 patients (4.2%). Oncological family history was investigated up to the third generation for all patients and was positive in 43/95 (45.3%) cases. We identified a total of 65 variants in 95 patients, distributed as follows: 48 variants of uncertain significance (73.8%), 10 likely pathogenic (15.4%), and 7 pathogenic variants (10.8%). Notably, our findings reveal that pathogenic/likely pathogenic variants were detected in about 17% of the entire study population, higher than the 10% incidence reported in the existing literature. The high rate of mutations in CPS associated genes described in our work, leads to consider performing NGS even in the absence of clinical or anamnestic criteria suggestive of it. However, ethical and social issues are to be considered when we propose and investigate patients for CPS. Moreover, further research are needed to determine the role of variants of uncertain significance.

: Differentiating pediatric posterior fossa (PF) tumors such as medulloblastoma (MB), ependymoma (EP), and pilocytic astrocytoma (PA) remains relevant, because of important treatment and prognostic implications. Diffusion kurtosis imaging (DKI) has not yet been investigated for discrimination of pediatric PF tumors. Estimating diffusion values from whole-tumor-based (VOI) segmentations may improve diffusion measurement repeatability compared to conventional region-of-interest (ROI) approaches. Our purpose was to compare repeatability between ROI and VOI DKI-derived diffusion measurements and assess DKI accuracy in discriminating among pediatric PF tumors.

Diffuse hemispheric gliomas, H3G34R/V-mutant (DHG-H3G34), are lethal brain tumors lacking targeted therapies. They originate from interneuronal precursors; however, leveraging this origin for therapeutic insights remains unexplored. Here, we delineate a cellular hierarchy along the interneuron lineage development continuum, revealing that DHG-H3G34 mirror spatial patterns of progenitor streams surrounding interneuron nests, as seen during human brain development. Integrating these findings with genome-wide CRISPR-Cas9 screens identifies genes upregulated in interneuron lineage progenitors as major dependencies. Among these, CDK6 emerges as a targetable vulnerability: DHG-H3G34 tumor cells show enhanced sensitivity to CDK4/6 inhibitors and a CDK6-specific degrader, promoting a shift toward more mature interneuron-like states, reducing tumor growth, and prolonging xenograft survival. Notably, a patient with progressive DHG-H3G34 treated with a CDK4/6 inhibitor achieved 17 months of stable disease. This study underscores interneuronal progenitor-like states, organized in characteristic niches, as a distinct vulnerability in DHG-H3G34, highlighting CDK6 as a promising clinically actionable target.

Optimal immune function is crucial in preventing cancer development and growth and for the success of anti-cancer therapies. Here, we characterized the peripheral immunological status of 83 steroids-naïve pediatric patients with central nervous system neoplasia at the disease onset. Tumors were classified into low-grade gliomas (LGG), high-grade gliomas (HGG), medulloblastoma, and other tumors. We revealed that glioma patients showed an altered lymphocyte pool. T-cells of HGG patients shifted from naïve to effector memory phenotype. LGG patients exhibited T-cell central memory expansion and higher T-cell activation. Interestingly, HGG patients displayed reduced thymic function. Furthermore, LGG and HGG patients showed reduced activated B-cells and suboptimal B-cell formation. Our data demonstrate that glioma patients have reduced lymphopoiesis at the disease onset, which could contribute to the systemic lymphopenia characterizing these patients. This study offers novel insights into the immunological status of brain tumor patients which may help in designing more effective treatments.

Highlights•Pediatric oncologists may not trust clinical decision supports based on AI•They would be concerned if AI is not trained with representative data•Pediatric oncologists would not properly explain how AI works to patients•They may stop using AI systems for diagnosis in case of a cyberattackAbstractBackgroundArtificial intelligence (AI) holds promise in pediatric oncology, yet its full potential faces challenges. We undertook a survey aimed at assessing the viewpoints of European pediatric oncologists delving into their perceptions and expectations regarding the potential influence of AI in their clinical workflows.MethodWe conducted a survey by means of four hypothetical scenarios using AI and the Shinners Artificial Intelligence Perception (SHAIP) tool to assess healthcare professionals' perceptions of AI in pediatric oncology. We performed multinomial logistic regression to explore associations of responses to clinical scenarios with age and SHAIP scores.ResultsWe obtained 140 responses and the analysis was performed on 108. The SHAIP questionnaire mean total score was 3.29 (SD 0.93) for the professional impact, and 2.37 (SD 0.61) for preparedness. Regarding the clinical scenarios, 34.9% of respondents would ask for a procedure for confirming their diagnosis in case of discrepancy between AI decision support and human diagnosis; 55.8% would be concerned about the generalizability an AI decision support system in case of lack of data from certain geographic areas during algorithm training; 47.6% would feel uncomfortable in the informed consent process for an AI intervention; 10.2% would no longer trust AI in case of a cyberattack affecting AI support for diagnosis.DiscussionThis survey underscores the importance of AI tools in pediatric oncology that incorporate human oversight in clinical decision-making and training AI algorithms with diverse and representative data. Our findings suggest that pediatric oncologists may not be adequately prepared for the seamless integration of AI in clinical practice.