To enable arrayed or pooled loss-of-function screens in a wide range of mammalian cell types, including primary and nondividing cells, we are developing lentiviral short hairpin RNA (shRNA) libraries targeting the human and murine genomes. The libraries currently contain 104,000 vectors, targeting each of 22,000 human and mouse genes with multiple sequence-verified constructs. To test the utility of the library for arrayed screens, we developed a screen based on high-content imaging to identify genes required for mitotic progression in human cancer cells and applied it to an arrayed set of 5,000 unique shRNA-expressing lentiviruses that target 1,028 human genes. The screen identified several known and ∼100 candidate regulators of mitotic progression and proliferation; the availability of multiple shRNAs targeting the same gene facilitated functional validation of putative hits. This work provides a widely applicable resource for loss-of-function screens, as well as a roadmap for its application to biological discovery.

A phylogenetic framework inferred from comparisons of small subunit ribosomal RNA sequences describes the evolutionary origin and early branching patterns of the kingdom Animalia. Maximum likelihood analyses show the animal lineage is monophyletic and includes choanoflagellates. Within the metazoan assemblage, the divergence of sponges is followed by the Ctenophora, the Cnidaria plus the placozoan Trichoplax adhaerens , and finally by an unresolved polychotomy of bilateral animal phyla. From these data, it was inferred that animals and fungi share a unique evolutionary history and that their last common ancestor was a flagellated protist similar to extant choanoflagellates.

Agrobacterium tumefaciens is a plant pathogen capable of transferring a defined segment of DNA to a host plant, generating a gall tumor. Replacing the transferred tumor-inducing genes with exogenous DNA allows the introduction of any desired gene into the plant. Thus, A. tumefaciens has been critical for the development of modern plant genetics and agricultural biotechnology. Here we describe the genome of A. tumefaciens strain C58, which has an unusual structure consisting of one circular and one linear chromosome. We discuss genome architecture and evolution and additional genes potentially involved in virulence and metabolic parasitism of host plants.

Abstract RNA interference (RNAi) is a potent and specific mechanism for regulating gene expression. Harnessing RNAi to silence genes involved in disease holds promise for the development of a new class of therapeutics. Delivery is key to realizing the potential of RNAi, and lipid nanoparticles (LNP) have proved effective in delivery of siRNAs to the liver and to tumors in animals. To examine the activity and safety of LNP-formulated siRNAs in humans, we initiated a trial of ALN-VSP, an LNP formulation of siRNAs targeting VEGF and kinesin spindle protein (KSP), in patients with cancer. Here, we show detection of drug in tumor biopsies, siRNA-mediated mRNA cleavage in the liver, pharmacodynamics suggestive of target downregulation, and antitumor activity, including complete regression of liver metastases in endometrial cancer. In addition, we show that biweekly intravenous administration of ALN-VSP was safe and well tolerated. These data provide proof-of-concept for RNAi therapeutics in humans and form the basis for further development in cancer. Significance: The findings in this report show safety, pharmacokinetics, RNAi mechanism of action, and clinical activity with a novel first-in-class LNP-formulated RNAi therapeutic in patients with cancer. The ability to harness RNAi to facilitate specific multitargeting, as well as increase the number of druggable targets, has important implications for future drug development in oncology. Cancer Discov; 3(4); 406–17. ©2012 AACR. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 363

Myxobacteria are single-celled, but social, eubacterial predators. Upon starvation they build multicellular fruiting bodies using a developmental program that progressively changes the pattern of cell movement and the repertoire of genes expressed. Development terminates with spore differentiation and is coordinated by both diffusible and cell-bound signals. The growth and development of Myxococcus xanthus is regulated by the integration of multiple signals from outside the cells with physiological signals from within. A collection of M. xanthus cells behaves, in many respects, like a multicellular organism. For these reasons M. xanthus offers unparalleled access to a regulatory network that controls development and that organizes cell movement on surfaces. The genome of M. xanthus is large (9.14 Mb), considerably larger than the other sequenced δ-proteobacteria. We suggest that gene duplication and divergence were major contributors to genomic expansion from its progenitor. More than 1,500 duplications specific to the myxobacterial lineage were identified, representing >15% of the total genes. Genes were not duplicated at random; rather, genes for cell–cell signaling, small molecule sensing, and integrative transcription control were amplified selectively. Families of genes encoding the production of secondary metabolites are overrepresented in the genome but may have been received by horizontal gene transfer and are likely to be important for predation.

RNA interference is a natural antiviral mechanism that could be harnessed to combat SARS-CoV-2 infection by targeting and destroying the viral RNA. We identified potent lipophilic small interfering RNA (siRNA) conjugates targeting highly conserved regions of SARS-CoV-2 outside of the spike-encoding region capable of achieving ≥3-log viral reduction. Serial passaging studies demonstrated that a two-siRNA combination prevented development of resistance compared to a single siRNA approach. Viral resistance to single siRNA treatment occurred due to emergence of point mutations at critical positions required for siRNA-mediated target binding and cleavage, which led to a loss of siRNA efficacy. With a two-siRNA combination, emergence of mutations within the siRNA binding site was abolished. When delivered intranasally, two-siRNA combination protected Syrian hamsters from weight loss and lung pathology by viral infection upon prophylactic administration but not following onset of infection. Together, the data support potential utility of RNAi as a prophylactic approach with high resistance barrier to counteract SARS-CoV-2 emergent variants and complement vaccination. Most importantly, given that the siRNAs can be rapidly developed from a new pathogen sequence, this strategy has implications as a new type of preventive medicine that may protect against future coronavirus pandemics.

Background: Destabilized transthyretin (TTR) can result in the progressive, fatal disease transthyretin-mediated (ATTR) amyloidosis. A stabilizing TTR mutation, T119M, is the basis for a therapeutic strategy to reduce destabilized TTR. Recently, T119M was associated with extended lifespan and lower risk of cerebrovascular disease in a Danish cohort. We aimed to determine whether this finding could be replicated in the UK Biobank. Methods: TTR T119M carriers were identified in the UK Biobank, a large prospective cohort of ~500,000 individuals. Association between T119M genotype and inpatient diagnosis of vascular disease, cardiovascular disease, cerebrovascular disease, and mortality was analyzed. Results: Frequency of T119M within the white UK Biobank population (n=337,148) was 0.4%. Logistic regression comparing T119M carriers to non-carriers found no association between T119M and vascular disease (odds ratio [OR]=1.08; p=.27), cardiovascular disease (OR=1.08; p=.31), cerebrovascular disease (OR=1.1; p=.42), or death (OR=1.2; p=.06). Cox proportional hazards regression showed similar results (hazard ratio>1, p>.05). Age at death and vascular disease diagnosis were similar between T119M carriers and non-carriers (p=.12 and p=.38, respectively). Conclusions: There was no association between the TTR T119M genotype and risk of vascular disease or death in a large prospective cohort study, indicating that TTR tetramer stabilization through T119M is not protective in this setting.

Abstract RNA interference is a natural antiviral mechanism that could be harnessed to combat SARS-CoV-2 infection by targeting and destroying the viral genome. We screened lipophilic small-interfering RNA (siRNA) conjugates targeting highly conserved regions of the SARS-CoV-2 genome and identified leads targeting outside of the spike-encoding region capable of achieving ≥3-log viral reduction. Serial passaging studies demonstrated that a two-siRNA combination prevented development of resistance compared to a single-siRNA approach. A two-siRNA combination delivered intranasally protected Syrian hamsters from weight loss and lung pathology by viral infection upon prophylactic administration but not following onset of infection. Together, the data support potential utility of RNAi as a prophylactic approach to limit SARS-CoV-2 infection that may help combat emergent variants, complement existing interventions, or protect populations where vaccines are less effective. Most importantly, this strategy has implications for developing medicines that may be valuable in protecting against future coronavirus pandemics.

To investigate mechanisms of hepatocellular damage, we performed genome-wide association studies (GWAS) on alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) serum activities across 411,048 subjects from four ancestry groups in the UK Biobank, and found 100 loci associating with both enzymes. The rare missense variant Thr95Ile (rs188273166) associates with a larger elevation in ALT and AST than any other variant tested and this association also replicates in the DiscovEHR study. SLC30A10 excretes manganese from the liver to the bile duct, and rare homozygous loss of function causes the syndrome hypermanganesemia with dystonia-1 (HMNDYT1) which involves cirrhosis. Consistent with hematological symptoms of hypermanganesemia, Thr95Ile carriers have increased hematocrit and risk of iron deficiency anemia. Carriers also have increased risk of extrahepatic bile duct cancer. These associations suggest that genetic variation in adversely affects more individuals than patients with diagnosed HMNDYT1.