Background

 Bacterial cells in the human body account for 1–3% of total body weight and are at least equal in number to human cells. Recent research has focused on understanding how the different bacterial communities in the body (eg, gut, respiratory, skin, and vaginal microbiomes) predispose to health and disease. The microbiota of the reproductive tract has been inferred from the vaginal bacterial communities, and the uterus has been classically considered a sterile cavity. However, while the vaginal microbiota has been investigated in depth, there is a paucity of consistent data regarding the existence of an endometrial microbiota and its possible impact in reproductive function. 

Objective

 This study sought to test the existence of an endometrial microbiota that differs from that in the vagina, assess its hormonal regulation, and analyze the impact of the endometrial microbial community on reproductive outcome in infertile patients undergoing in vitro fertilization. 

Study Design

 To identify the existence of an endometrial microbiota, paired samples of endometrial fluid and vaginal aspirates were obtained simultaneously from 13 fertile women in prereceptive and receptive phases within the same menstrual cycle (total samples analyzed n = 52). To investigate the hormonal regulation of the endometrial microbiota during the acquisition of endometrial receptivity, endometrial fluid was collected at prereceptive and receptive phases within the same cycle from 22 fertile women (n = 44). Finally, the reproductive impact of an altered endometrial microbiota in endometrial fluid was assessed by implantation, ongoing pregnancy, and live birth rates in 35 infertile patients undergoing in vitro fertilization (total samples n = 41) with a receptive endometrium diagnosed using the endometrial receptivity array. Genomic DNA was obtained either from endometrial fluid or vaginal aspirate and sequenced by 454 pyrosequencing of the V3–V5 region of the 16S ribosomal RNA (rRNA) gene; the resulting sequences were taxonomically assigned using QIIME. Data analysis was performed using R packages. The χ² test, Student t test, and analysis of variance were used for statistical analyses. 

Results

 When bacterial communities from paired endometrial fluid and vaginal aspirate samples within the same subjects were interrogated, different bacterial communities were detected between the uterine cavity and the vagina of some subjects. Based on its composition, the microbiota in the endometrial fluid, comprising up to 191 operational taxonomic units, was defined as a Lactobacillus-dominated microbiota (>90% Lactobacillus spp.) or a non-Lactobacillus-dominated microbiota (<90% Lactobacillus spp. with >10% of other bacteria). Although the endometrial microbiota was not hormonally regulated during the acquisition of endometrial receptivity, the presence of a non-Lactobacillus-dominated microbiota in a receptive endometrium was associated with significant decreases in implantation [60.7% vs 23.1% (P = .02)], pregnancy [70.6% vs 33.3% (P = .03)], ongoing pregnancy [58.8% vs 13.3% (P = .02)], and live birth [58.8% vs 6.7% (P = .002)] rates. 

Conclusion

 Our results demonstrate the existence of an endometrial microbiota that is highly stable during the acquisition of endometrial receptivity. However, pathological modification of its profile is associated with poor reproductive outcomes for in vitro fertilization patients. This finding adds a novel microbiological dimension to the reproductive process.

ObjectiveTo demonstrate the clinical value of the endometrial receptivity array (ERA) in patients with repeated implantation failure (RIF), for guiding their personalized embryo transfer (pET) as a novel therapeutic strategy.DesignProspective interventional multicenter clinical trial.SettingUniversity-affiliated infertility and private clinics.Patient(s)Eighty-five RIF patients and 25 comparison patients.Intervention(s)Endometrial sampling and pET guided by ERA.Main Outcome Measure(s)A receptive (R) or nonreceptive (NR) endometrial status according to ERA. Pregnancy (PR) and implantation (IR) rates after pET.Result(s)The ERA test gave an R result of 74.1% in RIF patients versus 88% in control subjects. Clinical follow-up was possible in 29 RIF patients, in whom pET was performed, resulting in 51.7% PR and 33.9% IR. The IRs and PRs in the 6 months after the biopsy showed that pregnancy was not related to the local injury. Twenty-two RIF patients (25.9%) were NR, and in 15 of them a second ERA validated a displacement of the window of implantation (WOI). In eight of them, pET was performed on the day designated by the ERA, resulting in 50.0% PR and 38.5% IR. These results should be considered as preliminary.Conclusion(s)There is an increased percentage of WOI displacement in RIF patients compared with comparison group patients, leading to the concept of pET as a therapeutic strategy. Rescue of NR patients by pET in a displaced WOI results in similar PR and IR. To demonstrate the clinical value of the endometrial receptivity array (ERA) in patients with repeated implantation failure (RIF), for guiding their personalized embryo transfer (pET) as a novel therapeutic strategy. Prospective interventional multicenter clinical trial. University-affiliated infertility and private clinics. Eighty-five RIF patients and 25 comparison patients. Endometrial sampling and pET guided by ERA. A receptive (R) or nonreceptive (NR) endometrial status according to ERA. Pregnancy (PR) and implantation (IR) rates after pET. The ERA test gave an R result of 74.1% in RIF patients versus 88% in control subjects. Clinical follow-up was possible in 29 RIF patients, in whom pET was performed, resulting in 51.7% PR and 33.9% IR. The IRs and PRs in the 6 months after the biopsy showed that pregnancy was not related to the local injury. Twenty-two RIF patients (25.9%) were NR, and in 15 of them a second ERA validated a displacement of the window of implantation (WOI). In eight of them, pET was performed on the day designated by the ERA, resulting in 50.0% PR and 38.5% IR. These results should be considered as preliminary. There is an increased percentage of WOI displacement in RIF patients compared with comparison group patients, leading to the concept of pET as a therapeutic strategy. Rescue of NR patients by pET in a displaced WOI results in similar PR and IR.

In a human menstrual cycle, the endometrium undergoes remodeling, shedding, and regeneration, all of which are driven by substantial gene expression changes in the underlying cellular hierarchy. Despite its importance in human fertility and regenerative biology, mechanistic understanding of this unique type of tissue homeostasis remains rudimentary. We characterized the transcriptomic transformation of human endometrium at single cell resolution, dissecting the multidimensional cellular heterogeneity of this tissue across the entire natural menstrual cycle. We profiled the behavior of 6 endometrial cell types, including a previously uncharacterized ciliated epithelial cell type, during four major phases of endometrial transformation, and found characteristic signatures for each cell type and phase. We discovered that human window of implantation opens with an abrupt and discontinuous transcriptomic activation in the epithelia, accompanied with widespread decidualized feature in the stromal fibroblasts. These data reveal signatures in the luminal and glandular epithelia during epithelial gland reconstruction, and suggest a mechanism for adult gland formation.

Abstract We investigated potential SARS-CoV-2 tropism in human endometrium by single-cell RNA-sequencing of viral entry-associated genes in healthy women. Percentages of endometrial cells expressing ACE2, TMPRSS2, CTSB , or CTSL were <2%, 12%, 80%, and 80%, respectively, with 0.7% of cells expressing all four genes. Our findings imply low efficiency of SARS-CoV-2 infection in the endometrium before embryo implantation, providing information to assess preconception risk in asymptomatic carriers.

Summary The transmission of DNA through extracellular vesicles (EVs) represents a novel genetic material transfer mechanism that may impact genome evolution and tumorigenesis. We aimed to investigate the potential for vertical DNA transmission within maternal endometrial EVs to the pre-implantation embryo and describe any effect on embryo bioenergetics. We discovered that the human endometrium secretes all three general subtypes of EV - apoptotic bodies (ABs), microvesicles (MVs), and exosomes (EXOs) - into the human endometrial fluid (EF) within the uterine cavity. EVs become uniformly secreted into the EF during the menstrual cycle, with the proportion of different EV populations remaining constant; however, MVs contain significantly higher levels of mitochondrial (mt)DNA than ABs or EXOs. During the window of implantation, MVs contain an eleven-fold higher level of mtDNA when compared to cells-of-origin within the receptive endometrium, which possesses a lower mtDNA content and displays the upregulated expression of mitophagy-related genes. Furthermore, we demonstrate the internalization of EV-derived nuclear-encoded (n)DNA/mtDNA by trophoblast cells of murine embryos, which associates with a reduction in mitochondrial respiration and ATP production. These findings suggest that the maternal endometrium suffers a reduction in mtDNA content during the preconceptional period, that nDNA/mtDNA become packaged into secreted EVs that the embryo uptakes, and that the transfer of DNA to the embryo within EVs occurs alongside the modulation of bioenergetics during implantation.

STUDY QUESTION: Does cellular composition of the endometrial biopsy affect the gene expression profile of endometrial whole-tissue samples? SUMMARY ANSWER: The differences in epithelial and stromal cell proportions in endometrial biopsies modify whole-tissue gene expression profiles, and also affect the results of differential expression analysis. WHAT IS ALREADY KNOWN: Each cell type has its unique gene expression profile. The proportions of epithelial and stromal cells vary in endometrial tissue during the menstrual cycle, along with individual and technical variation due to the way and tools used to obtain the tissue biopsy. STUDY DESIGN, SIZE, DURATION: Using cell-population specific transcriptome data and computational deconvolution approach, we estimated the epithelial and stromal cell proportions in whole-tissue biopsies taken during early secretory and mid-secretory phases. The estimated cellular proportions were used as covariates in whole-tissue differential gene expression analysis. Endometrial transcriptomes before and after deconvolution were compared and analysed in biological context. PARTICIPANTS/MATERIAL, SETTING, METHODS: Paired early and mid-secretory endometrial biopsies were obtained from thirty-five healthy, regularly cycling, fertile volunteers, aged 23 to 36 years, and analysed by RNA sequencing. Differential gene expression analysis was performed using two approaches. In one of them, computational deconvolution was applied as an intermediate step to adjust for epithelial and stromal cells' proportions in endometrial biopsy. The results were then compared to conventional differential expression analysis. MAIN RESULTS AND THE ROLE OF CHANCE: The estimated average proportions of stromal and epithelial cells in early secretory phase were 65% and 35%, and during mid-secretory phase 46% and 54%, respectively, that correlated well with the results of histological evaluation (r=0.88, p=1.1 × 10-6). Endometrial tissue transcriptomic analysis showed that approximately 26% of transcripts (n=946) differentially expressed in receptive endometrium in cell-type unadjusted analysis also remain differentially expressed after adjustment for biopsy cellular composition. However, the other 74% (n=2,645) become statistically non-significant after adjustment for biopsy cellular composition, underlining the impact of tissue heterogeneity on differential expression analysis. The results suggest new mechanisms involved in endometrial maturation involving genes like LINC01320, SLC8A1 and GGTA1P, described for the first time in context of endometrial receptivity. LIMITATIONS, REASONS FOR CAUTION: Only dominant endometrial cell types were considered in gene expression profile deconvolution; however, other less frequent endometrial cell types also contribute to the whole-tissue gene expression profile. WIDER IMPLICATIONS OF THE FINDINGS: The better understanding of molecular processes during transition from pre-receptive to receptive endometrium serves to improve the effectiveness and personalization of assisted reproduction protocols. Biopsy cellular composition should be taken into account in future endometrial 'omics' studies, where tissue heterogeneity could potentially influence the results.

Abstract STUDY QUESTION What changes occur in the endometrium during aging, and do they impact fertility? SUMMARY ANSWER Both the transcriptome and cellular composition of endometrial samples from women of advanced maternal age (AMA) are significantly different from that of samples from young women, suggesting specific changes in epithelial cells that may affect endometrial receptivity. WHAT IS KNOWN ALREADY Aging is associated with the accumulation of senescent cells in aging tissues. Reproductive aging is mostly attributed to the decline in ovarian reserve and oocyte quality, whereas the endometrium is a unique complex tissue that is monthly renewed under hormonal regulation. Several clinical studies have reported lower implantation and pregnancy rates in oocyte recipients of AMA during IVF. Molecular studies have indicated the presence of specific mutations within the epithelial cells of AMA endometrium, along with altered gene expression of bulk endometrial tissue. STUDY DESIGN, SIZE, DURATION Endometrial transcriptome profiling was performed for 44 women undergoing HRT during the assessment of endometrial receptivity before IVF. Patients younger than 28 years were considered as the young maternal age (YMA) group (age 23–27 years) and women older than 45 years were considered as the AMA group (age 47–50 years). Endometrial biopsies were obtained on Day 5 of progesterone treatment and RNA was extracted. All endometrial samples were evaluated as being receptive based on the expression of 68 common endometrial receptivity markers. Endometrial samples from another 24 women classified into four age groups (YMA, intermediate age group 1 (IMA1, age 29–35), intermediate age group 2 (IMA2, age 36–44), and AMA) were obtained in the mid-secretory stage of a natural cycle (NC) and used for validation studies across the reproductive lifespan. PARTICIPANTS/MATERIALS, SETTING, METHODS A total of 24 HRT samples (12 YMA and 12 AMA) were subject to RNA sequencing (RNA-seq) and differential gene expression analysis, 20 samples (10 YMA and 10 AMA) were used for qPCR validation, and 24 NC samples (6 YMA, 6 IMA1, 6 IMA2 and 6AMA) were used for RNA-seq validation of AMA genes across the woman’s reproductive lifespan. Immunohistochemistry (IHC) was used to confirm some expression changes at the protein level. Computational deconvolution using six endometrial cell type-specific transcriptomic profiles was conducted to compare the cellular composition between the groups. MAIN RESULTS AND THE ROLE OF CHANCE Comparisons between YMA and AMA samples identified a lower proportion of receptive endometria in the AMA group (P = 0.007). Gene expression profiling identified 491 differentially expressed age-sensitive genes (P adj &lt; 0.05) that revealed the effects of age on endometrial epithelial growth and receptivity, likely contributing to decreased reproductive performance. Our results indicate that changes in the expression of the cellular senescence marker p16INK4a and genes associated with metabolism, inflammation, and hormone response are involved in endometrial aging. Importantly, we demonstrate that the proportion of multi-ciliated cells, as discovered based on RNA-seq data deconvolution and tissue IHC results, is affected by endometrial aging, and propose a putative onset of age-related changes. Furthermore, we propose that aging has an impact on the transcriptomic profile of endometrial tissue in the context of endometrial receptivity. LARGE SCALE DATA The raw sequencing data reported in this article are deposited at the Gene Expression Omnibus under accession code GSE236128. LIMITATIONS, REASONS FOR CAUTION This retrospective study identified changes in the endometrium of patients undergoing hormonal replacement and validated these changes using samples obtained during a NC. However, future studies must clarify the importance of these findings on the clinical outcomes of assisted reproduction. WIDER IMPLICATIONS OF THE FINDINGS The findings reported in this study have important implications for devising future strategies aimed at improving fertility management in women of advanced reproductive age. STUDY FUNDING/COMPETING INTEREST(S) This research was funded by the Estonian Research Council (grant no. PRG1076), Horizon 2020 innovation grant (ERIN, grant no. EU952516), Enterprise Estonia (grant no. EU48695), MSCA-RISE-2020 project TRENDO (grant no. 101008193), EU 874867 project HUTER, the Horizon Europe NESTOR grant (grant no. 101120075) of the European Commission, the EVA specialty program (grant no. KP111513) of the Maastricht University Medical Center (MUMC+), MICIU/AEI/10.13039/501100011033 and FEDER, EU projects Endo-Map (grant no. PID2021-12728OB-100), ROSY (grant no. CNS2022-135999), and the National Science Fund of Bulgaria (grant no. KII-06 H31/2). The authors declare no competing interests.