Abstract The nuclei of rod photoreceptors in mice and other nocturnal species have an unusual inverted chromatin structure: the heterochromatin is centrally located to help focus light and improve photosensitivity. To better understand this unique nuclear organization, we performed ultra-deep Hi-C analysis on murine retina at 3 stages of development and on purified rod photoreceptors. Predicted looping interactions from the Hi-C data were validated with fluorescence in situ hybridization (FISH). We discovered that a subset of retinal genes that are important for retinal development, cancer, and stress response are localized to the facultative heterochromatin domain. We also used machine learning to develop an algorithm based on our chromatin Hidden Markov Modeling (chromHMM) of retinal development to predict heterochromatin domains and study their dynamics during retinogenesis. FISH data for 264 genomic loci were used to train and validate the algorithm. The integrated data were then used to identify a developmental stage– and cell type-specific core regulatory circuit super-enhancer (CRC-SE) upstream of the Vsx2 gene, which is required for bipolar neuron expression. Deletion of the Vsx2 CRC-SE in mice led to the loss of bipolar neurons in the retina.

Abstract Rhabdomyosarcoma (RMS) is a pediatric cancer with features of skeletal muscle; patients with unresectable or metastatic RMS fare poorly due to high rates of disease recurrence. Here, we use single cell and single nucleus RNA-sequencing to show that RMS tumors recapitulate the spectrum of embryonal myogenesis. Using matched patient samples from a clinical trial and orthotopic patient-derived xenografts (O-PDXs), we show chemotherapy eliminates the most proliferative component with features of myoblasts; after treatment, the quiescent immature population with features of paraxial mesoderm expands to reconstitute the developmental hierarchy of the original tumor. We discovered that this paraxial mesoderm population is dependent on EGFR signaling and is sensitive to EGFR inhibitors. Taken together, this data serves as a proof-of-concept that targeting each developmental state in RMS is an effective strategy for improving outcomes by preventing disease recurrence.

Super-enhancers (SEs) are expansive regions of genomic DNA that regulate the expression of genes involved in cell identity and cell fate. Recently, we found that distinct modules within a murine SE regulate gene expression of master regulatory transcription factor Vsx2 in a developmental stage- and cell-type specific manner. The Vsx2 SE is evolutionarily conserved in vertebrates, suggesting that these modules are important for retinal development across species. In the present study, we examine the ability of these modules to drive retinal development between species. By inserting the human build of one Vsx2 SE module into a mouse with microphthalmia, eye size was rescued. To understand the implications of these SE modules in a model of human development, we generated human retinal organoids. Deleting one module results in small organoids, recapitulating the small-eyed phenotype of mice with microphthalmia, while deletion of the other module leads to a complete loss of ON cone bipolar neurons. This prototypical SE serves as a model for uncoupling developmental stage- and cell-type specific effects of neurogenic transcription factors with complex expression patterns. Moreover, by elucidating the gene regulatory mechanisms, we can begin to examine how dysregulation of these mechanisms contributes to phenotypic diversity and disease.

Previous studies have demonstrated the dynamic changes in chromatin structure during retinal development that correlate with changes in gene expression. However, a major limitation of those prior studies was the lack of cellular resolution. Here, we integrate single-cell (sc) RNAseq and scATACseq with bulk retinal data sets to identify cell type specific changes in the chromatin structure during development. Although most genes promoter activity is strongly correlated with chromatin accessibility, we discovered several hundred genes that were transcriptionally silent but had accessible chromatin at their promoters. Most of those silent/accessible gene promoters were in the Muller glial cells. The Muller cells are radial glia of the retina and perform a variety of essential functions to maintain retinal homeostasis and respond to stress, injury, or disease. The silent/accessible genes in Muller glia are enriched in pathways related to inflammation, angiogenesis, and other types of cell-cell signaling and were rapidly activated when we tested 15 different physiologically relevant conditions to mimic retinal stress, injury, or disease in human and murine retinae. We refer to these as pliancy genes because they allow the Muller glia to rapidly change their gene expression and cellular state in response to different types of retinal insults. The Muller glial cell pliancy program is established during development, and we demonstrate that pliancy genes are necessary and sufficient for regulating inflammation in the murine retina in vivo. In zebrafish, Muller glia can de-differentiate and form retinal progenitor cells that replace lost neurons. The pro-inflammatory pliancy gene cascade is not activated in zebrafish Muller glia following injury, and we propose a model in which species-specific pliancy programs underly the differential response to retinal damage in species that can regenerate retinal neurons (zebrafish) versus those that cannot (humans and mice).