Summary

 Vessel sprouting by migrating tip and proliferating stalk endothelial cells (ECs) is controlled by genetic signals (such as Notch), but it is unknown whether metabolism also regulates this process. Here, we show that ECs relied on glycolysis rather than on oxidative phosphorylation for ATP production and that loss of the glycolytic activator PFKFB3 in ECs impaired vessel formation. Mechanistically, PFKFB3 not only regulated EC proliferation but also controlled the formation of filopodia/lamellipodia and directional migration, in part by compartmentalizing with F-actin in motile protrusions. Mosaic in vitro and in vivo sprouting assays further revealed that PFKFB3 overexpression overruled the pro-stalk activity of Notch, whereas PFKFB3 deficiency impaired tip cell formation upon Notch blockade, implying that glycolysis regulates vessel branching.

A procedure, based on the complex formation of malachite green with phosphomolybdate under acidic conditions, to measure inorganic orthophosphate in the nanomolar range is described. The addition of polyvinyl alcohol is required to stabilize the dye-phosphomolybdate complex. The advantages of the assay are simplicity, stability of the reagents, and high sensitivity. Due to the high permissible acidity in the assay (0.9 N H2SO4), the method can be adapted easily to measure nanomolar amounts of phosphate, liberated from organic compounds like phosphoproteins and phospholipids after wet digestion.

Abstract Activation of de novo lipogenesis in cancer cells is increasingly recognized as a hallmark of aggressive cancers and has been implicated in the production of membranes for rapid cell proliferation. In the current report, we provide evidence that this activation has a more profound role. Using a mass spectrometry–based phospholipid analysis approach, we show that clinical tumor tissues that display the lipogenic phenotype show an increase in the degree of lipid saturation compared with nonlipogenic tumors. Reversal of the lipogenic switch in cancer cells by treatment with the lipogenesis inhibitor soraphen A or by targeting lipogenic enzymes with small interfering RNA leads to a marked decrease in saturated and mono-unsaturated phospholipid species and increases the relative degree of polyunsaturation. Because polyunsaturated acyl chains are more susceptible to peroxidation, inhibition of lipogenesis increases the levels of peroxidation end products and renders cells more susceptible to oxidative stress–induced cell death. As saturated lipids pack more densely, modulation of lipogenesis also alters lateral and transversal membrane dynamics as revealed by diffusion of membrane-targeted green fluorescent protein and by the uptake and response to doxorubicin. These data show that shifting lipid acquisition from lipid uptake toward de novo lipogenesis dramatically changes membrane properties and protects cells from both endogenous and exogenous insults. These findings provide important new insights into the role of de novo lipogenesis in cancer cells, and they provide a rationale for the use of lipogenesis inhibitors as antineoplastic agents and as chemotherapeutic sensitizers. Cancer Res; 70(20); 8117–26. ©2010 AACR.

The metabolism of endothelial cells during vessel sprouting remains poorly studied. Here we report that endothelial loss of CPT1A, a rate-limiting enzyme of fatty acid oxidation (FAO), causes vascular sprouting defects due to impaired proliferation, not migration, of human and murine endothelial cells. Reduction of FAO in endothelial cells did not cause energy depletion or disturb redox homeostasis, but impaired de novo nucleotide synthesis for DNA replication. Isotope labelling studies in control endothelial cells showed that fatty acid carbons substantially replenished the Krebs cycle, and were incorporated into aspartate (a nucleotide precursor), uridine monophosphate (a precursor of pyrimidine nucleoside triphosphates) and DNA. CPT1A silencing reduced these processes and depleted endothelial cell stores of aspartate and deoxyribonucleoside triphosphates. Acetate (metabolized to acetyl-CoA, thereby substituting for the depleted FAO-derived acetyl-CoA) or a nucleoside mix rescued the phenotype of CPT1A-silenced endothelial cells. Finally, CPT1 blockade inhibited pathological ocular angiogenesis in mice, suggesting a novel strategy for blocking angiogenesis. This study identifies a crucial role for fatty acid oxidation (FAO) in endothelial cells during angiogenesis, and reveals that fatty-acid-derived carbons are used for the de novo synthesis of nucleotides, and hence FAO stimulates vessel sprouting by increasing endothelial cell proliferation. Peter Carmeliet and colleagues identify a crucial role for the oxidation of fatty acids in endothelial cells during angiogenesis. They show that fatty acids provide the carbons for the de novo synthesis of nucleotides, and hence fatty acid oxidation stimulates vessel sprouting by increasing endothelial cell proliferation. Pharmacological blockade of fatty acid oxidation can reduce pathological angiogenesis in a mouse model of retinopathy of prematurity.

Abstract Ever since the first characterization of peroxisomes, a central theme has been their involvement in cellular hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) metabolism. While the reputation of H 2 O 2 drastically changed from an exclusively toxic molecule to a signaling messenger, the regulatory role of peroxisomes in these signaling events is still largely underappreciated. This is mainly because the number of known protein targets of peroxisome-derived H 2 O 2 is rather limited and testing of specific targets is predominantly based on knowledge previously gathered in related fields of research. To gain a broader and more systematic insight into the role of peroxisomes in redox signaling, an unbiased approach is urgently needed. To accomplish this goal, we have combined a previously developed cell system in which peroxisomal H 2 O 2 production can be modulated with a yeast AP-1-like-based sulfenome mining strategy to inventory protein thiol targets of peroxisome-derived H 2 O 2 in different subcellular compartments. Using this unbiased approach, we were able to identify specific and common targets of peroxisome-derived and exogenous H 2 O 2 in peroxisomes, the cytosol, and mitochondria. We also observed that the sulfenylation kinetics profiles of key targets belonging to different protein families can vary considerably. In addition, we obtained compelling but indirect evidence that peroxisome-derived H 2 O 2 may oxidize at least some of its targets through a redox relay mechanism. In conclusion, given that sulfenic acids function as key intermediates in H 2 O 2 signaling, the findings presented in this study provide initial but critical insight into how peroxisomes may be integrated in the cellular H 2 O 2 signaling network. Highlights YAP1C-trapping is a robust tool to assess the peroxisomal H 2 O 2 -dependent sulfenome Exogenous and peroxisome-derived H 2 O 2 have both common and distinct targets ANXA2, PRDX1, and SKP1 are major targets of peroxisome-derived H 2 O 2 The sulfenylation kinetics profiles of key redox-active proteins vary considerably Production of H 2 O 2 inside peroxisomes directly impacts the mitochondrial sulfenome

Abstract Purpose Patients deficient in peroxisomal β-oxidation, which is essential for the synthesis of docosahexaenoic acid (DHA, C22:6n-3) and breakdown of very long-chain polyunsaturated fatty acids (VLC-PUFAs), both important components of photoreceptor outer segments, present with retinopathy. The representative mouse model lacking the central enzyme of this pathway, multifunctional protein 2 ( Mfp2 −/− ), also develops early onset retinal decay and cell-autonomous retinal pigment epithelium (RPE) degeneration, accompanied by reduced plasma and retinal DHA levels. In this study, we investigated whether DHA supplementation can rescue the retinal degeneration of Mfp2 −/− mice. Methods Mfp2 +/− breeding pairs and their offspring were fed a 0.12% DHA or control diet during gestation, lactation and until sacrifice. Offspring were analysed for retinal function via electroretinograms, for lipid composition of neural retina and plasma with lipidome analysis and gas chromatography respectively, and histologically using retinal sections and RPE flatmounts at the age of 4, 8 and 16 weeks. Results DHA supplementation to Mfp2 −/− mice restored retinal DHA levels and prevented photoreceptor shortening, impaired functioning and death until 8 weeks. In addition, rescue of retinal DHA levels temporarily improved the ability of the RPE to phagocytose outer segments and delayed the RPE dedifferentiation. However, despite the initial rescue of retinal integrity, DHA supplementation could not prevent retinal degeneration at 16 weeks. Conclusions We reveal that the shortage of systemic supply of DHA is pivotal for the early retinal degeneration in Mfp2 −/− mice. Furthermore, we unveil that adequate retinal DHA levels are essential for both photoreceptor and RPE homeostasis.

Astrocytes play multiple functions in the central nervous system, from control of blood flow through to modulation of synaptic activity. Transient increases in intracellular Ca2+ are thought to control these activities. The prevailing concept is that these Ca2+ transients are triggered by distinct pathways, with little mechanistic and functional overlap. Here we demonstrate that astrocytes in visual cortex of mice encode local visual signals in conjunction with arousal state, functioning as multi-modal integrators. Such activity adds an additional layer of complexity to astrocyte function and may enable astrocytes to specifically and subtly regulate local network activity and plasticity.