Abstract The ability to predict responsiveness to drugs in individual patients is limited. We hypothesized that integrating molecular information from databases would yield predictions that could be experimentally tested to develop genomic signatures for sensitivity or resistance to specific drugs. We analyzed TCGA data for lung adenocarcinoma (LUAD) patients and identified a subset where xanthine dehydrogenase expression correlated with decreased survival. We tested allopurinol, a FDA approved drug that inhibits xanthine dehydrogenase on a library of human Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) cell lines from CCLE and identified sensitive and resistant cell lines. We utilized the gene expression profiles of these cell lines to identify six-gene signatures for allopurinol sensitive and resistant cell lines. Network building and analyses identified JAK2 as an additional target in allopurinol-resistant lines. Treatment of resistant cell lines with allopurinol and CEP-33779 (a JAK2 inhibitor) resulted in cell death. The effectiveness of allopurinol alone or allopurinol and CEP-33779 were verified in vivo using tumor formation in NCR-nude mice. We utilized the six-gene signatures to predict five additional allopurinolsensitive NSCLC lines, and four allopurinol-resistant lines susceptible to combination therapy. We found that drug treatment of all cell lines yielded responses as predicted by the genomic signatures. We searched the library of patient derived NSCLC tumors from Jackson Laboratory to identify tumors that would be predicted to be sensitive or resistant to allopurinol treatment. Both patient derived tumors predicted to be allopurinol sensitive showed the predicted sensitivity, and the predicted resistant tumors were sensitive to combination therapy. These data indicate that we can use integrated molecular information from cancer databases to predict drug responsiveness in individual patients and thus enable precision medicine.

Abstract Drug-induced gene expression profiles can identify potential mechanisms of toxicity. We focused on obtaining signatures for cardiotoxicity of FDA-approved tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Using bulk transcriptomics profiles, we applied singular value decomposition to identify drug-selective patterns in cell lines obtained from multiple healthy human subjects. Cellular pathways affected by highly cardiotoxic TKIs include energy metabolism, contractile, and extracellular matrix dynamics. Projecting these pathways to single cell expression profiles indicates that TKI responses can be evoked in both cardiomyocytes and fibroblasts. Whole genome sequences of the cell lines, using outlier responses enabled us to correctly reidentify a genomic variant associated with anthracycline cardiotoxicity and predict genomic variants potentially associated with TKI cardiotoxicity. We conclude that mRNA expression profiles when integrated with publicly available genomic, pathway, and single cell transcriptomic datasets, provide multiscale predictive understanding of cardiotoxicity for drug development and patient stratification. One sentence summary Genes, pathways, and cell types of the human heart associated with antineoplastic drug cardiotoxicity.

Axonal regeneration in the mature CNS is limited by inhibitory factors within the extracellular environment. In this study, we show that histones H3 and H4 inhibit neurite outgrowth when applied to cortical neurons in vitro, and that this effect can be reversed by the addition of activated protein C (APC). Elevated levels of histones H3 and H4 were also detected in cerebrospinal fluid following CNS injury, and treatment with APC significantly increased axonal regeneration. Mechanistically, we have determined that histones activate a retrograde signaling cascade that results in phosphorylation of the transcription factor YB-1, and that neurite outgrowth is impaired when YB-1 is overexpressed in cortical neurons. These findings identify extracellular histones as a new class of growth-inhibiting molecules within the injured CNS.

Injured central nervous system (CNS) axons do not regenerate, due to lack of intrinsic capacity of the neurons and the inhibitory environment at the injury site. Currently, there are no drugs or drug combinations to promote axonal regeneration in the injured spinal cord or optic nerve. We used a systems pharmacology approach to develop a four-drug combination with the potential to increase neuronal capacity by regulating multiple subcellular processes at the cell body to trigger long neurites in inhibitory environments. Dynamical computational models of neurite outgrowth showed that the transcriptional effects of drugs applied at the cell body when combined with drugs that work locally near the site of the injured axons could produce extensive synergistic growth. We used the optic nerve crush in rats to test the drug combinations. We intravitreally injected two drugs, HU-210 (cannabinoid receptor-1 agonist) and IL-6 (interleukin 6 receptor agonist) to stimulate retinal ganglion cells (RGCs) whose axons had been crushed, and applied two drugs in gel foam, taxol to stabilize microtubules and activated protein C (APC) to potentially clear the injury site debris field. Morphology experiments using the injured optic nerve show that the four-drug combination promotes robust axonal regeneration from the RGC to the chiasm. Electrophysiologically the four-drug treatment restored pattern electroretinograms (pERG), and about 25% of the animals had detectable visual evoked potentials (VEP) in the brain. We conclude that systems pharmacology-based drug treatment can promote functional axonal regeneration after nerve injury.

Abstract Introduction Neurons transport mRNA and translational machinery to axons for local translation. After spinal cord injury (SCI), de novo translation is assumed to enable neurorepair. Knowledge of the identity of axonal mRNAs that participate in neurorepair after SCI is limited. We sought to identify and understand how axonal RNAs play a role in axonal regeneration. Methods We obtained preparations enriched in axonal mRNAs from control and SCI rats by digesting spinal cord tissue with cold-active protease (CAP). The digested samples were then centrifuged to obtain a supernatant that were then sequenced. We used bioinformatics analyses to identify DEGS and map them to various biological processes. We validated the DEGs by RT-qPCR and RNA-scope. Results The supernatant fraction was highly enriched for axonal mRNA. Using Gene Ontology, the second most significant pathway for all differentially expressed genes (DEGs) was axonogenesis. Among the DEGs was Rims2, which is predominately a circular RNA (circRNA) in the CNS. We show that Rims2 RNA within spinal cord axons is circular. We found an additional 200 putative circRNAs in the axonal-enriched fraction. Knockdown in primary rat cortical neurons of the RNA editing enzyme ADAR1, which inhibits formation of circRNAs, significantly increased axonal outgrowth. Focusing on Rims2 we used Circular RNA Interactome to predict that several of the miRNAs that bind to circRims2 also bind to the 3’UTR of GAP-43, PTEN or CREB1, all known regulators of axonal outgrowth. Axonally-translated GAP-43 supports axonal elongation and we detect GAP-43 mRNA in the rat axons by RNAscope. Discussion By using our method for enrichment of axonal RNA, we detect SCI induced DEGs, including circRNA such as Rims2. Ablation of ADAR1, the enzyme that regulates circRNA formation, promotes axonal outgrowth of cortical neurons. We developed a pathway model using Circular RNA Interactome that indicates that Rims2 through miRNAs can regulate the axonal translation GAP-43 a known regulator of axonal regeneration indicating that axonal mRNA contribute to regeneration.

Neurite outgrowth is an integrated whole cell response regulated by cannabinoid-1 receptor. To understand underlying mechanisms, we identified subcellular processes (SCPs) and their interactions required for the response. Differentially expressed genes and proteins upon receptor stimulation of neuronal cells were used informatically to build networks of SCPs and their interactions. From SCP networks we identified additional genes, which when ablated validated the SCP involvement in neurite outgrowth. The experiments and informatics analyses identified diverse SCPs such as those involved in pyrimidine metabolism, lipid biosynthesis, mRNA splicing and stability along with membrane vesicle and microtubule dynamics. We find that SCPs required for neurite outgrowth are widely distributed among constitutive cellular functions. Several of these SCPs are deep since they are distal to cell signaling pathways and proximal SCPs involved in microtubule growth and membrane vesicle dynamics. We conclude that receptor regulation of SCPs for neurite outgrowth is distributed and deep.

Whole cell responses involve multiple subcellular processes (SCPs). To understand how balance between SCPs controls the dynamics of whole cell responses we studied neurite outgrowth in rat primary cortical neurons in culture. We used a combination of dynamical models and experiments to understand the conditions that permitted growth at a specified velocity and when aberrant growth could lead to the formation of dystrophic bulbs. We hypothesized that dystrophic bulb formation is due to quantitative imbalances between SCPs. Simulations predict redundancies between lower level sibling SCPs within each type of high level SCP. In contrast, higher level SCPs, such as vesicle transport and exocytosis or microtubule growth characteristic of each type need to be strictly coordinated with each other and imbalances result in stalling of neurite outgrowth. From these simulations, we predicted the effect of changing the activities of SCPs involved in vesicle exocytosis or microtubule growth could lead to formation of dystrophic bulbs. siRNA ablation experiments verified these predictions. We conclude that whole cell dynamics requires balance between the higher-level SCPs involved and imbalances can terminate whole cell responses such as neurite outgrowth.