Exploiting nervous paths already traveled The parasympathetic nervous system helps regulate the functions of many tissues and organs, including the salivary glands and the esophagus. To do so, it needs to reach throughout the body, connecting central systems to peripheral ones. Dyachuk et al. and Espinosa-Medina et al. explored how these connections are established in mice (see the Perspective by Kalcheim and Rohrer). Progenitor cells that travel along with the developing nerves can give rise to both myelinforming Schwann cells and to parasympathetic neurons. That means the interacting nerves do not have to find each other. Instead, the beginnings of the connections are laid down as the nervous system develops. Science , this issue p. 82 , p. 87 ; see also p. 32

Summary Delineating cell lineages is a prerequisite for understanding the genesis of cell types. Recent studies have demonstrated the feasibility of generating and reconstructing CRISPR/Cas9-coded cell lineages. However, these works have not investigated the limitations or optimality of the encoding or reconstruction processes. Here, we surveyed a multitude of reconstruction algorithms and found hierarchical clustering, with a metric based on the number of shared Cas9 edits, provides the best reconstruction. As to the efficiency, the simple encoding method, with constant Cas9/gRNA edit rate, produces exponential reduction in available coding units and severely limits the trackable depth of lineages. To overcome this, we propose alternative encoding methods, one based on parallel gRNA cascades enabled by CLADES, and another based on variable Cas9 editing rate. Both significantly increase the trackable depth. In summary, we provide a theoretical basis in understanding, designing and analyzing efficient and robust CRISPR-based cell lineage tracking system.

Abstract Acquiring both lineage and cell-type information during brain development could elucidate transcriptional programs underling neuronal diversification. This is now feasible with single-cell RNA-seq combined with CRISPR-based lineage tracing, which generates genetic barcodes with cumulative CRISPR edits. This technique has not yet been optimized to deliver high-resolution lineage reconstruction of protracted lineages. Drosophila neuronal lineages are an ideal model to consider, as multiple lineages have been morphologically mapped at single-cell resolution. Here we find the parameter ranges required to encode a representative neuronal lineage emanating from 100 stem cell divisions. We derive the optimum editing rate to be inversely proportional to lineage depth, enabling encoding to persist across lineage progression. Further, we experimentally determine the editing rates of a Cas9-deaminase in cycling neural stem cells, finding near ideal rates to map elongated Drosophila neuronal lineages. Moreover, we propose and evaluate strategies to separate recurring cell-types for lineage reconstruction. Finally, we present a simple method to combine multiple experiments, which permits dense reconstruction of protracted cell lineages despite suboptimum lineage encoding and sparse cell sampling.

Abstract During development, regulatory factors appear in a precise order to determine cell fates over time. To investigate complex tissue development, one should not just label cell lineages but further visualize and manipulate cells with temporal control. Current strategies for tracing vertebrate cell lineages lack genetic access to sequentially produced cells. Here we present TEMPO (Temporal Encoding and Manipulation in a Predefined Order), an imaging-readable genetic tool allowing differential labelling and manipulation of consecutive cell generations in vertebrates. TEMPO is based on CRISPR and powered by a cascade of gRNAs that drive orderly activation/inactivation of reporters/effectors. Using TEMPO to visualize zebrafish and mouse neurogenesis, we recapitulated birth-order-dependent neuronal fates. Temporally manipulating cell-cycle regulators in mouse cortex progenitors altered the proportion and distribution of neurons and glia, revealing the effects of temporal gene perturbation on serial cell fates. Thus, TEMPO enables sequential manipulation of molecular factors, crucial to study cell-type specification. One-Sentence Summary Gaining sequential genetic access to vertebrate cell lineages.

Gaining independent genetic access to discrete cell types is critical to interrogate their biological functions, as well as to deliver precise gene therapy. Transcriptome analyses have allowed us to profile cell populations with extraordinary precision, revealing that cell types are typically defined by a unique combination of genetic markers. Given the lack of adequate tools to target cell types based on multiple markers, most cell types have remained inaccessible to genetic manipulation. Here, we present CaSSA, a platform to create unlimited genetic switches based on CRISPR/Cas9 (Ca) and the DNA repair mechanism known as single-strand annealing (SSA). CaSSA allows engineering of independent genetic switches that each respond to a specific gRNA. Expressing multiple gRNAs in specific patterns enables multiplex cell type-specific manipulations and combinatorial genetic targeting. CaSSA is thus a new genetic tool that conceptually works as an unlimited number of recombinases and will facilitate genetic access to cell types in diverse organisms.

We present CLADES (Cell Lineage Access Driven by an Edition Sequence), a technology for cell lineage studies based on CRISPR/Cas9. CLADES relies on a system of genetic switches to activate and inactivate reporter genes in a pre-determined order. Targeting CLADES to progenitor cells allows the progeny to inherit a sequential cascade of reporters, coupling birth order with reporter expression. This gives us temporal resolution of lineage development that can be used to deconstruct an extended cell lineage by tracking the reporters expressed in the progeny. When targeted to the germ line, the same cascade progresses across animal generations, marking each generation with the corresponding combination of reporters. CLADES thus offers an innovative strategy for making programmable cascades of genes that can be used for genetic manipulation or to record serial biological events.

Developing cells divide and differentiate, and in many tissues, such as bone, muscle, and placenta, cells fuse acquiring specialized functions. While it is known that fused-cells are differentiated, it is unclear what mechanisms trigger the programmatic-change, and whether cell-fusion alone drives differentiation. To address this, we employed a fusogen-mediated cell-fusion system involving undifferentiated cells in tissue culture. RNA-seq analysis revealed cell-fusion initiates a dramatic transcriptional change towards differentiation. Dissecting the mechanisms causing this reprogramming, we observed that after cell-fusion plasma-membrane surface area decreases through increased endocytosis. Consequently, glucose-transporters are internalized, and cytoplasmic-glucose and ATP transiently decrease. This low-energetic state activates AMPK, which inhibits YAP1, causing cell-cycle arrest. Impairing either endocytosis or AMPK prevents YAP1 inhibition and cell-cycle arrest after fusion. Together these data suggest that cell-fusion-induced differentiation does not need to rely on extrinsic-cues; rather the plasma-membrane diminishment forced by the geometric-transformations of cell-fusion cause transient cell-starvation that induces differentiation.