Under many conditions the killing of bacterial cells by antibiotics is potentiated by DNA damage induced by reactive oxygen species (ROS) 1–3 . A primary cause of ROS-induced cell death is the accumulation of DNA double-strand breaks (DSBs) 1,4–6 . DNA polymerase IV (pol IV), an error-prone DNA polymerase produced at elevated levels in cells experiencing DNA damage, has been implicated both in ROS-dependent killing and in DSBR 7–15 . Here, we show using single-molecule fluorescence microscopy that ROS-induced DSBs promote pol IV activity in two ways. First, exposure to the antibiotics ciprofloxacin and trimethoprim triggers an SOS-mediated increase in intracellular pol IV concentrations that is strongly dependent on both ROS and DSBR. Second, in cells that constitutively express pol IV, treatment with an ROS scavenger dramatically reduces the number of pol IV foci formed upon exposure to antibiotics, indicating a role for pol IV in the repair of ROS-induced DSBs.

ABSTRACT Methionine residues are particularly sensitive to oxidation by reactive oxygen or chlorine species (ROS/RCS), leading to the appearance of methionine sulfoxide in proteins. This post-translational oxidation can be reversed by omnipresent protein repair pathways involving methionine sulfoxide reductases (Msr). In the periplasm of Escherichia coli , the enzymatic system MsrPQ, whose expression is triggered by the RCS, controls the redox status of methionine residues. Here we report that MsrPQ synthesis is also induced by copper stress via the CusSR two-component system, and that MsrPQ plays a role in copper homeostasis by maintaining the activity of the copper efflux pump, CusCFBA. Genetic and biochemical evidence suggest the metallochaperone CusF is the substrate of MsrPQ and our study reveal that CusF methionines are redox sensitive and can be restored by MsrPQ. Thus, the evolution of a CusSR-dependent synthesis of MsrPQ allows keeping copper homeostasis under aerobic conditions by maintenance of the reduced state of Met residues in copper-trafficking proteins. AUTHOR SUMMARY Our study investigates the interconnection between the copper stress response and the methionine redox homeostasis in the Gram-negative bacterium Escherichia coli . We report that the copper-activation of the CusSR two-component system induces the expression of the periplasmic oxidized-protein repair system, MsrPQ. We demonstrate that MsrPQ is crucial for CusCFBA copper efflux pump activity under aerobic conditions as it maintains the periplasmic component CusF in its functional reduced form. Methionine emerges as a critical residue in copper trafficking proteins: however this naturally-selected advantage must be balanced by methionine’s high susceptibility to oxidation. Therefore the induction of MsrPQ by copper allows copper homeostasis under aerobic conditions, illustrating that E. coli has developed an integrated and dynamic circuit for sensing and counteracting stress caused by copper and oxidants, thus allowing bacteria to adapt to host cellular defences.

Abstract Collisions between DNA replication complexes (replisomes) and impediments such as damaged DNA or proteins tightly bound to the chromosome lead to premature dissociation of replisomes at least once per cell cycle in Escherichia coli . Left unrepaired, these events produce incompletely replicated chromosomes that cannot be properly partitioned into daughter cells. DNA replication restart, the process that reloads replisomes at prematurely terminated sites, is therefore essential in E. coli and other bacteria. Three replication restart pathways have been identified in E. coli : PriA/PriB, PriA/PriC, and PriC/Rep. A limited number of genetic interactions between replication restart and other genome maintenance pathways have been defined, but a systematic study placing replication restart reactions in a broader cellular context has not been performed. We have utilized transposon insertion sequencing to identify new genetic interactions between DNA replication restart pathways and other cellular systems. Known genetic interactors with the priB replication restart gene (uniquely involved in the PriA/PriB pathway) were confirmed and several novel priB interactions were discovered. Far fewer connections were found with the PriA/PriC or PriC/Rep pathways, suggesting a primacy role for the PriA/PriB pathway in E. coli . Targeted genetic and imaging-based experiments with priB and its genetic partners revealed significant double-strand DNA break (DSB) accumulation in strains with mutations in dam, rep, rdgC, lexA , or polA . Modulating the activity of the RecA recombinase partially suppressed the detrimental effects of rdgC or lexA mutations in Δ priB cells. Taken together, our results highlight roles for several genes in DSB homeostasis and define a genetic network that facilitates DNA repair/processing upstream of PriA/PriB-mediated DNA replication restart in E. coli . Author Summary All organisms rely on DNA replication to grow, develop, and reproduce. In bacteria, the cellular machinery that carries out DNA replication is estimated to fail and prematurely dissociate from the genome at least once per cell cycle. As a result, bacteria have evolved “DNA replication restart” mechanisms that resuscitate failed replication reactions. To probe the function and context of DNA replication restart in the bacterium Escherichia coli , we employed a genetic screen to identify genes that were conditionally important in mutant E. coli strains compromised in their ability to perform DNA replication restart. Identification of genes with previously known relationships with DNA replication restart confirmed the robustness of our screen, while additional findings implicated novel genetic relationships. Targeted experiments validated the importance of these genes and provided an explanation for their significance in preventing double-strand DNA breaks in cells, a severe form of DNA damage. Our results help to define specific roles for the genes identified by our screen and elucidate the contextual environment of DNA repair upstream of DNA replication restart in E. coli .

Abstract Single-stranded DNA gaps form within the E. coli chromosome during replication, repair and recombination. However, information about the extent of ssDNA creation in the genome is limited. To complement a recent whole-genome sequencing study revealing ssDNA gap genomic distribution, size, and frequency, we used fluorescence microscopy to monitor the spatiotemporal dynamics of single-stranded DNA within live E. coli cells. The ssDNA was marked by a functional fluorescent protein fusion of the SSB protein that replaces the wild type SSB. During log-phase growth the SSB fusion produces a mixture of punctate foci and diffuse fluorescence spread throughout the cytosol. Many foci are clustered. Fluorescent markers of DNA polymerase III frequently co-localize with SSB foci, often localizing to the outer edge of the large SSB features. Novel SSB-enriched features form and resolve regularly during normal growth. UV irradiation induces a rapid increase in SSB foci intensity and produces large features composed of multiple partially overlapping foci. The results provide a critical baseline for further exploration of ssDNA generation during DNA metabolism. Alterations in the patterns seen in a mutant lacking RecB function tentatively suggest associations of particular SSB features with the repair of double strand breaks and post-replication gaps.

ABSTRACT Two component systems (TCS) are signalling pathways that allow bacterial cells to sense, respond and adapt to fluctuating environments. Among the classical TCS of Escherichia coli , YedVW has been recently showed to be involved in the regulation of msrPQ , encoding for the periplasmic methionine sulfoxide reductase system. In this study, we demonstrate that hypochlorous acid (HOCl) induces the expression of msrPQ in a YedVW dependant manner, whereas H 2 O 2 , NO and paraquat (a superoxide generator) do not. Therefore, YedV appears to be an HOCl-sensing histidine kinase. Based on this finding, we proposed to rename this system HypVW. Moreover, using a directed mutagenesis approach, we show that Met residues located in the periplasmic loop of HypV (formerly YedV) are important for its activity. Given that HOCl oxidizes preferentially Met residues, we bring evidences that HypV could be activated via the reversible oxidation of its methionine residues, thus conferring to MsrPQ a role in switching HypVW off. Based on these results, we propose that the activation of HypV by HOCl could occur through a Met redox switch. HypVW appears to be the first characterized TCS able to detect HOCl in E. coli . This study represents an important step in understanding the mechanisms of reactive chlorine species resistance in prokaryotes. IMPORTANCE Understanding molecularly how bacteria respond to oxidative stress is crucial to fight pathogens. HOCl is one of the most potent industrial and physiological microbiocidal oxidant. Therefore, bacteria have developed counterstrategies to survive HOCl-induced stress. Over the last decade, important insights into these bacterial protection factors have been obtained. Our work establishes HypVW as an HOCl-sensing two component system in Escherichia coli MG1655 which regulates the expression of the periplasmic HOCl-oxidized proteins repair system MsrPQ. Moreover we bring evidences suggesting that HOCl could activate HypV through a methionine redox switch.