Abstract Cholestatic itch is a severe and debilitating symptom in liver diseases with limited treatment options. The class A G protein-coupled receptor (GPCR) Mas-related GPCR subtype X4 (MRGPRX4) has been identified as a receptor for bile acids, which are potential cholestatic pruritogens. An increasing number of GPCRs have been shown to interact with receptor activity-modifying proteins (RAMPs), which can modulate different aspects of GPCR biology. Using a combination of multiplexed immunoassay and proximity ligation assay we show that MRGPRX4 interacts with RAMPs. The interaction of MRGPRX4 with RAMP2, but not RAMP1 or 3, causes attenuation of basal and agonist-dependent signaling, which correlates with a decrease of MRGPRX4 cell surface expression as measured using a quantitative NanoBRET pulse-chase assay. Finally, we use AlphaFold Multimer to predict the structure of the MRGPRX4-RAMP2 complex. The discovery that RAMP2 regulates MRGPRX4 may have direct implications for future drug development for cholestatic itch.

Although receptor activity-modifying proteins (RAMPs) have been shown to modulate the functions of several different G protein-coupled receptors (GPCRs), potential direct interactions among the three known RAMPs and hundreds of GPCRs has never been investigated. We engineered three epitope-tagged RAMPs and 23 epitope-tagged GPCRs, focusing on the secretin-like family of GPCRs, and developed a suspension bead array (SBA) immunoassay designed to detect RAMP-GPCR complexes. We then used 64 antibodies raised against native RAMPs and GPCRs, along with four antibodies targeting the epitope tags, to multiplex the SBA assay to detect and measure all possible combinations of interaction among the 23 GPCRs and three RAMPs. The results of the SBA assay provide a complete interactome of secretin-like GPCRs with RAMPs. We demonstrate direct interaction of previously reported secretin-like GPCRs whose functions are modulated by RAMPs. We also discovered novel sets of GPCR-RAMP interacting pairs, and found additional secretin-like GPCRs, chemokine receptors and orphan receptors that interact with RAMPs. Using in situ proximity ligation assay, we verified a subset of these novel GPCR-RAMP interactions in cell membranes. In total, we found GPCR-RAMP interactions for the majority of the 23 GPCRs tested. Each GPCR interacted with either all three RAMPs or with RAMP2 and RAMP3, with the exception of one GPCR that interacted with just RAMP3. In summary, we describe an SBA strategy that will be useful to search for GPCR-RAMP interactions in cell lines and tissues, and conclude that GPCR-RAMP interactions are more common than previously appreciated.

The chemokine receptor CCR5 is a drug target to prevent transmission of HIV/AIDS. We studied four analogs of the native chemokine RANTES (CCL5) that have anti-HIV potencies of around 25 pM, which is more than four orders-of-magnitude higher than that of RANTES itself. It has been hypothesized that the ultra-high potency of the analogs is due to their ability to bind populations of receptors not accessible to native chemokines. To test this hypothesis, we developed a homogeneous dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) assay for saturation and competition binding experiments. The FCCS assay has the advantage that it does not rely on competition with radioactively labeled native chemokines used in conventional assays. We prepared site-specifically labeled fluorescent analogs using native chemical ligation of synthetic peptides, followed by bioorthogonal fluorescent labeling. We engineered a mammalian cell expression construct to provide fluorescently labeled CCR5, which was purified using a tandem immunoaffinity and size-exclusion chromatography approach to obtain monomeric fluorescent CCR5 in detergent solution. We found subnanomolar binding affinities for the two analogs 5P12-RANTES and 5P14-RANTES, and about twenty-fold reduced affinities for PSC-RANTES and 6P4-RANTES. Using homologous and heterologous competition experiments with unlabeled chemokine analogs, we conclude that the analogs all bind at the same binding site; whereas, the native chemokines (RANTES and MIP1α) fail to displace bound fluorescent analogs even at tens of micromolar concentrations. Our results can be rationalized with de novo structural models of the N-terminal tails of the synthetic chemokines that adopt a different binding mode as compared to the parent compound.

Objective The aim of this study was to make unstructured neuropathological data, located in the NeuroBioBank (NBB), follow FAIR principles, and investigate the potential of Large Language Models (LLMs) in wrangling unstructured neuropathological reports. By making the currently inconsistent and disparate data findable, our overarching goal was to enhance research output and speed. Materials and Methods The NBB catalog currently includes information from medical records, interview results, and neuropathological reports. These reports contain crucial information necessary for conducting in-depth analysis of NBB data but have multiple formats that vary across sites and change over time. In this study we focused on a subset of donors with Parkinson9s Disease (PD). We developed a data model with combined Brain Region and Pathological Findings data at its core. This approach made it easier to build an extraction pipeline and was flexible enough to convert resulting data to Common Data Elements (CDEs) used by the community. Results This pilot study demonstrated the potential of LLMs in structuring unstructured neuropathological reports of PD patients available in the NBB. The pipeline enabled successful extraction of microscopic and macroscopic findings and staging information from pathology reports, with extraction quality comparable to results of manual curation. To our knowledge, this is the first attempt to automatically standardize neuropathological information at this scale. The collected data has the potential to serve as a valuable resource for PD researchers, bridging the gap between clinical information and genetic data, thereby facilitating a more comprehensive understanding of the disease.