ABSTRACT Sialic acids (Sia) are widely displayed on the surfaces of cells and tissues. Sia come in a variety of chemically modified forms, including those with acetyl modifications at the C7, C8, and C9 positions. Here, we analyzed the distribution and amounts of these acetyl modifications in different human and canine cells. As Sia or their variant forms are receptors for influenza A and influenza C viruses, we examined the effects of these modifications on virus infections. We confirmed that 9- O -acetyl and 7,9- O -acetyl modified Sia are widely but variably expressed across cell lines from both humans and canines. While they were expressed on the cell surface of canine MDCK cell lines, they were located primarily within the Golgi compartment of human HEK-293 and A549 cells. The O -acetyl modified Sia were expressed at low levels of 1-2% of total Sia in these cell lines. We knocked out and over-expressed the sialate O -acetyltransferase gene (CasD1), and knocked out the sialate O -acetylesterase gene (SIAE) using CRISPR/Cas9 editing. Knocking out CasD1 removed 7,9- O - and 9- O -acetyl Sia expression, confirming previous reports. However, over-expression of CasD1 and knockout of SIAE gave only modest increases in 9- O -acetyl levels in cells and no change in 7,9- O -acetyl levels, indicating that there are complex regulations of these modifications. These modifications were essential for influenza C infection, but had no obvious effect on influenza A infection. IMPORTANCE Sialic acids are key glycans that are involved in many different normal cellular functions, as well as being receptors for many pathogens. However, Sia come in diverse chemically modified forms. Here we examined and manipulated the expression of 7,9- O - and 9- O -acetyl modified Sia on cells commonly used in influenza virus and other research by engineering the enzymes that produce or remove the acetyl groups.

New methods for deep sequence analysis provide an opportunity to follow the emergence and dynamics of virus mutations in real time. Although viruses are commonly grown in cell culture for research and for vaccine development, the cells used to grow the virus are often not derived from the same tissue or even the same host that the virus naturally replicates in. The selective pressures of culturing virus in vitro are still only partially understood. MDCK cells are the standard cell for growing influenza viruses yet are derived from the epithelium of the canine kidney and are also heterogenous. We passaged human H3N2, H1N1 pandemic, and canine H3N2 influenza A viruses (IAV) in different lineages of MDCK cells, as well as lines engineered to express variant Sia receptors, including α2,3- and α2,6-linkages or N -glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) or N -acetylneuraminic acid (Neu5Ac) forms. MDCK-Type II cells had lower infection efficiency and virus production, and infection appeared more dependent on protease activation of the virus. When viruses were passaged in the different cells, they exhibited only small numbers of consensus-level mutations, and most were within the HA gene. Both human IAVs showed selection for single nucleotide minority variants in the HA stem across cell types, as well as low frequency variants in the HA receptor binding site of virus passaged in cells expressing Neu5Gc. Canine H3N2 also showed minority variants near the receptor-binding site in cells expressing Neu5Gc and also in those expressing α2,6-linkages.

Influenza A viruses have regularly jumped to new hosts to cause epidemics or pandemics, an evolutionary process that involves variation in the viral traits necessary to overcome host barriers and facilitate transmission. Mice are not a natural host for influenza virus, but are frequently used as models in studies of pathogenesis, often after multiple passages to achieve higher viral titers that result in clinical disease such as weight loss or death. Here we examine the processes of influenza A virus infection and evolution in mice by comparing deep sequence variation of a human H1N1 pandemic virus, a seasonal H3N2 virus, and a H3N2 canine influenza virus during experimental passage. We also compared replication and sequence variation in wild-type mice expressing N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) with that seen in mice expressing only N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac). Viruses derived from plasmids were propagated in MDCK cells and then passaged in mice up to four times. Full genome deep sequencing of the plasmids, cultured viruses, and viruses from mice at various passages revealed only small numbers of mutational changes. The H3N2 canine influenza virus showed increases in frequency of sporadic mutations in the PB2, PA, and NA segments. The H1N1 pandemic virus grew well in mice, and while it exhibited the maintenance of some minority mutations, there was no clear adaptive evolution. The H3N2 seasonal virus did not establish in the mice. Finally, there were no clear sequence differences associated with the presence or absence of Neu5Gc.

ABSTRACT Human and avian influenza A viruses bind to sialic acid (Sia) receptors on cells as their primary receptors, and this results in endocytic uptake of the virus. While the role of Sia on glycoproteins and/or glycolipids for virus entry is crucial, the roles of the carrier proteins are still not well understood. Furthermore, it is still unclear how receptor binding leads to infection, including whether the receptor plays a structural or other roles beyond being a simple tether. To enable the investigation of the receptor binding and cell entry processes in a more controlled manner, we have designed a protein receptor for pandemic H1 influenza A viruses. The engineered receptor possesses the binding domains of an anti-HA antibody prepared as a single chain variable fragment (scFv) fused with the stalk, transmembrane and cytoplasmic sequences of the feline transferrin receptor type-1 (fTfR). When expressed in cells that lack efficient display of Sia due to a knockout of the Slc35A1 gene which encodes for the Solute Carrier Family 35 transporter (SLC35A1), the anti-H1 receptor was displayed on the cell surface, bound virus or hemagglutinin proteins, and the virus was efficiently endocytosed into the cells. Infection occurred at similar levels to those seen after Sia reconstitution, and treatment with clathrin-mediated endocytosis (CME) inhibitors significantly reduced viral entry. IMPORTANCE. Influenza A viruses mostly circulate among avian reservoirs, and also can jump hosts to cause epidemics in mammals, including among humans. A key interaction of the viruses is with host cell Sia, which vary in chemical form, in their linkages within the oligosaccharide, and in the attachment to surface glycoproteins or glycolipids with different properties. Here we report a new method for examining the processes of receptor binding and uptake into cells during influenza A virus infection, by use of an engineered HA-binding membrane glycoprotein, where an antibody is used as the binding domain and the transferrin receptor uptake structures mediate efficient entry, which should allow us to test and manipulate the processes of cell binding, entry, and infection.

Canine parvovirus (CPV) is a small non-enveloped single-stranded DNA virus that causes serious diseases in dogs worldwide. The original strain of the virus (CPV-2) emerged in dogs during the late-1970s due to a host range switch of a virus similar to the feline panleukopenia virus (FPV) that infected another host. The virus that emerged in dogs had altered capsid receptor- and antibody-binding sites, with some changes affecting both functions. Further receptor and antibody binding changes arose when the virus became better adapted to dogs or to other hosts. Here, we use in vitro selection and deep sequencing to reveal how two antibodies with known interactions select for escape mutations in CPV. The antibodies bind two distinct epitopes, and one largely overlaps the host receptor binding site. We also engineered antibody variants with altered binding structures. Viruses were passaged with the wild type or mutated antibodies, and their genomes deep sequenced during the selective process. A small number of mutations were detected only within the capsid protein gene during the first few passages of selection, and most sites remained polymorphic or were slow to go to fixation. Mutations arose both within and outside the antibody binding footprints on the capsids, and all avoided the TfR-binding footprint. Many selected mutations matched those that have arisen in the natural evolution of the virus. The patterns observed reveal the mechanisms by which these variants have been selected in nature and provide a better understanding of the interactions between antibody and receptor selections.Antibodies protect animals against infection by many different viruses and other pathogens, and we are gaining new information about the epitopes that induce antibody responses against viruses and the structures of the bound antibodies. However, less is known about the processes of antibody selection and antigenic escape and the constraints that apply in this system. Here, we use an in vitro model system and deep genome sequencing to reveal the mutations that arise in the virus genome during selection by each of two monoclonal antibodies or their engineered variants. High-resolution structures of each of the Fab: capsid complexes revealed their binding interactions. The engineered forms of the wild-type antibodies or mutant forms allowed us to examine how changes in antibody structure influence the mutational selection patterns seen in the virus. The results shed light on the processes of antibody binding, neutralization escape, and receptor binding, and likely have parallels for many other viruses.

Host antibody responses are key components in the protection of animals against pathogens, yet the defining properties of viral antigens and induction of B cell responses that result in varied protection are still poorly understood. Parvoviruses are simple molecular structures that display 60 repeated motifs on their capsid surface, and rapidly induce strong antibody responses that protect animals from infection. We recently showed that following canine parvovirus infection of its natural host, the polyclonal response in the sera contained only two or three dominant antibodies that bound two epitopes on the capsid. Here, we characterize key antibodies present in that immune response, identifying their sequences, defining their binding properties on the capsid by cryoelectron microscopic (cryoEM) analysis, and testing their effects on viral infectivity. Two antibodies sharing the same heavy chain bound to the side of the capsid threefold spike (B-site), while another distinct antibody bound close to the threefold axis (A-site). The epitopes of these antibodies overlapped the binding site of the host receptor, the transferrin receptor type-1, but to varying degrees. The antibodies varied widely in their neutralization efficiencies as either immunoglobulins (IgGs) or monomeric antigen-binding fragments (Fabs), which was consistent with their ability to compete for the receptor. The monoclonal antibodies characterized here matched the structures from the cryoEM analysis of polyclonal sera, including those present in a different dog than the monoclonal source. This shows that after infection, a focused response to the viral antigen is produced that protects against infection.