TASK channels are unusual members of the two-pore domain potassium (K 2P ) channel family, with unique and unexplained physiological and pharmacological characteristics. TASKs are found in neurons 1,2 , cardiomyocytes 3–5 and vascular smooth muscle cells 6 where they are involved in regulation of heart rate 7 , pulmonary artery tone 6,8 , sleep/wake cycles 9 and responses to volatile anaesthetics 9–12 . K 2P channels regulate the resting membrane potential, providing background K + currents controlled by numerous physiological stimuli 13,14 . Unlike other K 2P channels, TASK channels have the capacity to bind inhibitors with high affinity, exceptional selectivity and very slow compound washout rates. These characteristics make the TASK channels some of the the most easily druggable potassium channels, and indeed TASK-1 inhibitors are currently in clinical trials for obstructive sleep apnea (OSA) and atrial fibrillation (Afib) 15 (The DOCTOS and SANDMAN Trials). Generally, potassium channels have an intramembrane vestibule with a selectivity filter above and a gate with four parallel helices below. However, K 2P channels studied to date all lack a lower gate. Here we present the structure of TASK-1, revealing a unique lower gate created by interaction of the two crossed C-terminal M4 transmembrane helices at the vestibule entrance, which we designate as an ‟X-gate”. This structure is formed by six residues (V 243 LRFMT 248 ) that are essential for responses to volatile anaesthetics 11 , neuro-transmitters 16 and G-protein coupled receptors 16 . Interestingly, mutations within the X-gate and surrounding regions drastically affect both open probability and activation by anaesthetics. Structures of TASK-1 with two novel, high-affinity blockers, shows both inhibitors bound below the selectivity filter, trapped in the vestibule by the X-gate, thus explaining their exceptionally low wash-out rates. Thus, the presence of the X-gate in TASK channels explains many aspects of their unusual physiological and pharmacological behaviour, which is invaluable for future development and optimization of TASK modulators for treatment of heart, lung and sleep disorders.

Abstract Two-pore domain K + (K 2P ) channel activity was previously thought to be controlled primarily via a selectivity filter (SF) gate. However, recent crystal structures of TASK-1 and TASK-2 revealed a lower gate at the cytoplasmic pore entrance. Here, we report functional evidence of such a lower gate in the K 2P channel K2P17.1 (TALK-2, TASK-4). We identified compounds (drugs and lipids) and mutations that opened the lower gate allowing the fast modification of pore cysteine residues. Surprisingly, stimuli that exclusively target the SF gate (i.e., pH e ., Rb + permeation, membrane depolarization) also opened the cytoplasmic gate suggesting that the SF can induce global structural changes in TALK-2. Reciprocally, opening of the lower gate reduced the electrical work required to force ions into the SF to induce its opening as apparent in large shifts of the conductance-voltage (G-V) curves. These shifts, thereby, represent the mechanical work done by the SF to induce a global structural re-arrangement that opened the lower gate. In conclusion, it appears that the SF is so rigidly locked into the TALK-2 protein structure that changes in ion occupancy can pry open a distant lower gate. Vice versa, we show that opening of the lower gate concurrently forces the SF gate to open. This concept might extent to other K + channels that contain two gates (e.g., voltage-gated K + channels) for which such a positive gate coupling has been suggested, but so far not directly demonstrated. Synopsis TALK-2 channels, like most K 2P channels, possess a functional gate in the selectivity filter (SF; the upper gate) that is opened by rising extracellular pH and voltage-dependent ion binding (voltage gating). A second (lower) permeation gate in TALK-2 at the cytoplasmic end of TM4 is identified using cysteine modification, scanning mutagenesis and structural modelling. This gate can be opened by anionic lipids (LC-CoA) as well as pharmacological ligands (e.g., 2-APB). The modification reactivity of a cysteine introduced between the two gates reveal that stimuli targeting the SF gate also open the lower gate. Furthermore, stimuli that open the lower gate reduce the voltage (i.e., electrical work or mechanical load) required to open the SF gate. These findings demonstrate a tight positive coupling between the two gates. The concept of strong positive gate coupling might extend to other K + channels with two gates (e.g., voltage-gated K + channels) for which positive gate coupling has been suggested but so far not directly demonstrated.