Abstract

 Ca_V1.2, the cardiac L-type calcium channel, is important for excitation and contraction of the heart. Its role in other tissues is unclear. Here we present Timothy syndrome, a novel disorder characterized by multiorgan dysfunction including lethal arrhythmias, webbing of fingers and toes, congenital heart disease, immune deficiency, intermittent hypoglycemia, cognitive abnormalities, and autism. In every case, Timothy syndrome results from the identical, de novo Ca_V1.2 missense mutation G406R. Ca_V1.2 is expressed in all affected tissues. Functional expression reveals that G406R produces maintained inward Ca²⁺ currents by causing nearly complete loss of voltage-dependent channel inactivation. This likely induces intracellular Ca²⁺ overload in multiple cell types. In the heart, prolonged Ca²⁺ current delays cardiomyocyte repolarization and increases risk of arrhythmia, the ultimate cause of death in this disorder. These discoveries establish the importance of Ca_V1.2 in human physiology and development and implicate Ca²⁺ signaling in autism.

Timothy syndrome (TS) is a multisystem disorder that causes syncope and sudden death from cardiac arrhythmias. Prominent features include congenital heart disease, immune deficiency, intermittent hypoglycemia, cognitive abnormalities, and autism. All TS individuals have syndactyly (webbing of fingers and toes). We discovered that TS resulted from a recurrent, de novo cardiac L-type calcium channel (Ca V 1.2) mutation, G406R. G406 is located in alternatively spliced exon 8A, encoding transmembrane segment S6 of domain I. Here, we describe two individuals with a severe variant of TS (TS2). Neither child had syndactyly. Both individuals had extreme prolongation of the QT interval on electrocardiogram, with a QT interval corrected for heart rate ranging from 620 to 730 ms, causing multiple arrhythmias and sudden death. One individual had severe mental retardation and nemaline rod skeletal myopathy. We identified de novo missense mutations in exon 8 of Ca V 1.2 in both individuals. One was an analogous mutation to that found in exon 8A in classic TS, G406R. The other mutation was G402S. Exon 8 encodes the same region as exon 8A, and the two are mutually exclusive. The spliced form of Ca V 1.2 containing exon 8 is highly expressed in heart and brain, accounting for ≈80% of Ca V 1.2 mRNAs. G406R and G402S cause reduced channel inactivation, resulting in maintained depolarizing L-type calcium currents. Computer modeling showed prolongation of cardiomyocyte action potentials and delayed afterdepolarizations, factors that increase risk of arrhythmia. These data indicate that gain-of-function mutations of Ca V 1.2 exons 8 and 8A cause distinct forms of TS.

Inward rectifier potassium channels of the Kir2 subfamily are important determinants of the electrical activity of brain and muscle cells. Genetic mutations in Kir2.1 associate with Andersen-Tawil syndrome (ATS), a familial disorder leading to stress-triggered periodic paralysis and ventricular arrhythmia. To identify the molecular mechanisms of this stress trigger, we analyze Kir channel function and localization electrophysiologically and by time-resolved confocal microscopy. Furthermore, we employ a mathematical model of muscular membrane potential. We identify a novel corticoid signaling pathway that, when activated by glucocorticoids, leads to enrichment of Kir2 channels in the plasma membranes of mammalian cell lines and isolated cardiac and skeletal muscle cells. We further demonstrate that activation of this pathway can either partly restore (40% of cases) or further impair (20% of cases) the function of mutant ATS channels, depending on the particular Kir2.1 mutation. This means that glucocorticoid treatment might either alleviate or deteriorate symptoms of ATS depending on the patient's individual Kir2.1 genotype. Thus, our findings provide a possible explanation for the contradictory effects of glucocorticoid treatment on symptoms in patients with ATS and may open new pathways for the design of personalized medicines in ATS therapy.

TASK channels are unusual members of the two-pore domain potassium (K 2P ) channel family, with unique and unexplained physiological and pharmacological characteristics. TASKs are found in neurons 1,2 , cardiomyocytes 3–5 and vascular smooth muscle cells 6 where they are involved in regulation of heart rate 7 , pulmonary artery tone 6,8 , sleep/wake cycles 9 and responses to volatile anaesthetics 9–12 . K 2P channels regulate the resting membrane potential, providing background K + currents controlled by numerous physiological stimuli 13,14 . Unlike other K 2P channels, TASK channels have the capacity to bind inhibitors with high affinity, exceptional selectivity and very slow compound washout rates. These characteristics make the TASK channels some of the the most easily druggable potassium channels, and indeed TASK-1 inhibitors are currently in clinical trials for obstructive sleep apnea (OSA) and atrial fibrillation (Afib) 15 (The DOCTOS and SANDMAN Trials). Generally, potassium channels have an intramembrane vestibule with a selectivity filter above and a gate with four parallel helices below. However, K 2P channels studied to date all lack a lower gate. Here we present the structure of TASK-1, revealing a unique lower gate created by interaction of the two crossed C-terminal M4 transmembrane helices at the vestibule entrance, which we designate as an ‟X-gate”. This structure is formed by six residues (V 243 LRFMT 248 ) that are essential for responses to volatile anaesthetics 11 , neuro-transmitters 16 and G-protein coupled receptors 16 . Interestingly, mutations within the X-gate and surrounding regions drastically affect both open probability and activation by anaesthetics. Structures of TASK-1 with two novel, high-affinity blockers, shows both inhibitors bound below the selectivity filter, trapped in the vestibule by the X-gate, thus explaining their exceptionally low wash-out rates. Thus, the presence of the X-gate in TASK channels explains many aspects of their unusual physiological and pharmacological behaviour, which is invaluable for future development and optimization of TASK modulators for treatment of heart, lung and sleep disorders.

Abstract Background The Popeye domain containing (POPDC) genes encode sarcolemma-localised cAMP effector proteins. Mutations in BVES (POPDC1) and POPDC2 have been associated with limb-girdle muscular dystrophy and cardiac arrhythmia. Muscle biopsies of affected patients display impaired membrane trafficking of both POPDC isoforms. Methods Biopsy material of patients carrying mutations in BVES were immunostained with POPDC antibodies. The interaction of POPDC proteins was investigated by co-precipitation, proximity ligation, bioluminescence resonance energy transfer and bimolecular fluorescence complementation. Site-directed mutagenesis was utilised to map the domains involved in protein interaction. Findings Patients carrying a novel homozygous variant, BVES (c.547G>T, p.V183F) displayed only a skeletal muscle pathology and a mild impairment of membrane trafficking of both POPDC isoforms. This is in contrast to variants such as BVES p.Q153X or POPDC2 p.W188X, which were associated with a greater impairment of membrane trafficking. Co-transfection analysis in HEK293 cells revealed that POPDC proteins interact with each other through a helix-helix interface located at the C-terminus of the Popeye domain. Site-directed mutagenesis of an array of ultra-conserved hydrophobic residues demonstrated that some of them are required for membrane trafficking of the POPDC1-POPDC2 complex. Interpretation Mutations in POPDC proteins that cause an impairment in membrane localisation affect POPDC complex formation while mutations which leave the protein interaction intact likely affect some other essential function of POPDC proteins. Funding This study was funded by an EPSRC/British Heart Foundation co-funded Imperial Institute of Chemical Biology (ICB) Centre for Doctoral Training (CDT) PhD studentship (EP/S023518/1), a project grant of the British Heart Foundation (PG19/13/34247) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1482/9-1). Research in Context Evidence before this study Several biallelic missense and nonsense variants in BVES (POPDC1) have been described and are associated with heart and skeletal muscle disease. Skeletal muscle biopsies of homozygous carriers of these variants display a loss of sarcolemmal localisation of POPDC1 and POPDC2. Added value of this study We demonstrate that POPDC1 and POPDC2 form a heteromeric complex and that complex formation is required for plasma membrane trafficking of POPDC proteins. Transfection of different disease variants in HEK293 cells replicates their defective membrane targeting observed in biopsy material. Structural modelling and site-directed mutagenesis identifies an interface of strongly conserved hydrophobic residues in POPDC proteins, which likely mediate the interaction of POPDC proteins. Implications of all the available evidence These data provide novel insight into the membrane targeting requirements of POPDC proteins. We recommend testing the membrane targeting properties of any novel variant in POPDC isoforms using a newly developed co-transfection assay in HEK293 cells to characterise its pathogenicity. Our novel insight into the requirement of heterodimerization for proper membrane targeting may also offer novel opportunities to treat patients carrying mutations in POPDC proteins.

Abstract Two-pore domain K + (K 2P ) channel activity was previously thought to be controlled primarily via a selectivity filter (SF) gate. However, recent crystal structures of TASK-1 and TASK-2 revealed a lower gate at the cytoplasmic pore entrance. Here, we report functional evidence of such a lower gate in the K 2P channel K2P17.1 (TALK-2, TASK-4). We identified compounds (drugs and lipids) and mutations that opened the lower gate allowing the fast modification of pore cysteine residues. Surprisingly, stimuli that exclusively target the SF gate (i.e., pH e ., Rb + permeation, membrane depolarization) also opened the cytoplasmic gate suggesting that the SF can induce global structural changes in TALK-2. Reciprocally, opening of the lower gate reduced the electrical work required to force ions into the SF to induce its opening as apparent in large shifts of the conductance-voltage (G-V) curves. These shifts, thereby, represent the mechanical work done by the SF to induce a global structural re-arrangement that opened the lower gate. In conclusion, it appears that the SF is so rigidly locked into the TALK-2 protein structure that changes in ion occupancy can pry open a distant lower gate. Vice versa, we show that opening of the lower gate concurrently forces the SF gate to open. This concept might extent to other K + channels that contain two gates (e.g., voltage-gated K + channels) for which such a positive gate coupling has been suggested, but so far not directly demonstrated. Synopsis TALK-2 channels, like most K 2P channels, possess a functional gate in the selectivity filter (SF; the upper gate) that is opened by rising extracellular pH and voltage-dependent ion binding (voltage gating). A second (lower) permeation gate in TALK-2 at the cytoplasmic end of TM4 is identified using cysteine modification, scanning mutagenesis and structural modelling. This gate can be opened by anionic lipids (LC-CoA) as well as pharmacological ligands (e.g., 2-APB). The modification reactivity of a cysteine introduced between the two gates reveal that stimuli targeting the SF gate also open the lower gate. Furthermore, stimuli that open the lower gate reduce the voltage (i.e., electrical work or mechanical load) required to open the SF gate. These findings demonstrate a tight positive coupling between the two gates. The concept of strong positive gate coupling might extend to other K + channels with two gates (e.g., voltage-gated K + channels) for which positive gate coupling has been suggested but so far not directly demonstrated.

Abstract Loss-of-function mutations in K v 7.1 often lead to long QT syndrome (LQTS), a cardiac repolarization disorder associated with increased risk of arrhythmia and subsequent sudden cardiac death. The discovery of agonistic I Ks modulators may offer a new potential strategy in pharmacological treatment of this disorder. The benzodiazepine ( R )-L3 potently activates K v 7.1 channels and shortens action potential duration, thus may represent a starting point for drug development. However, the molecular mechanisms underlying modulation by ( R )-L3 are still unknown. By combining alanine scanning mutagenesis, non-canonical amino acid incorporation, voltage-clamp electrophysiology and fluorometry, and in silico protein modelling, we showed that ( R )-L3 not only stimulates currents by allosteric modulation of the pore domain but also alters the kinetics independently from the pore domain effects. We identified novel ( R )-L3-interacting key residues in the lower S4-segment of K v 7.1 and observed an uncoupling of the outer S4 segment with the inner S5, S6 and selectivity filter segments. Summarizing, we provide structural and functional evidence for two independent K v 7.1 activating mechanisms by a single modulator.