AtHMA4 is an Arabidopsis thaliana P 1B ‐ATPase which transports Zn and Cd. Here, we demonstrate that AtHMA4 is localized at the plasma membrane and expressed in tissues surrounding the root vascular vessels. The ectopic overexpression of AtHMA4 improved the root growth in the presence of toxic concentrations of Zn, Cd and Co. A null mutant exhibited a lower translocation of Zn and Cd from the roots to shoot. In contrast, the AtHMA4 overexpressing lines displayed an increase in the zinc and cadmium shoot content. Altogether, these results strongly indicate that AtHMA4 plays a role in metal loading in the xylem.

Abstract Nitric oxide (NO) functions as a cell-signaling molecule in plants. In particular, a role for NO in the regulation of iron homeostasis and in the plant response to toxic metals has been proposed. Here, we investigated the synthesis and the role of NO in plants exposed to cadmium (Cd2+), a nonessential and toxic metal. We demonstrate that Cd2+ induces NO synthesis in roots and leaves of Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) seedlings. This production, which is sensitive to NO synthase inhibitors, does not involve nitrate reductase and AtNOA1 but requires IRT1, encoding a major plasma membrane transporter for iron but also Cd2+. By analyzing the incidence of NO scavenging or inhibition of its synthesis during Cd2+ treatment, we demonstrated that NO contributes to Cd2+-triggered inhibition of root growth. To understand the mechanisms underlying this process, a microarray analysis was performed in order to identify NO-modulated root genes up- and down-regulated during Cd2+ treatment. Forty-three genes were identified encoding proteins related to iron homeostasis, proteolysis, nitrogen assimilation/metabolism, and root growth. These genes include IRT1. Investigation of the metal and ion contents in Cd2+-treated roots in which NO synthesis was impaired indicates that IRT1 up-regulation by NO was consistently correlated to NO's ability to promote Cd2+ accumulation in roots. This analysis also highlights that NO is responsible for Cd2+-induced inhibition of root Ca2+ accumulation. Taken together, our results suggest that NO contributes to Cd2+ toxicity by favoring Cd2+ versus Ca2+ uptake and by initiating a cellular pathway resembling those activated upon iron deprivation.

Microalgae are regarded as promising organisms to develop innovative concepts based on their photosynthetic capacity that offers more sustainable production than heterotrophic hosts. However, to realize their potential as green cell factories, a major challenge is to make microalgae easier to engineer. A promising approach for rapid and predictable genetic manipulation is to use standardized synthetic biology tools and workflows. To this end we have developed a Modular Cloning toolkit for the green microalga Chlamydomonas reinhardtii. It is based on Golden Gate cloning with standard syntax, and comprises 119 openly distributed genetic parts, most of which have been functionally validated in several strains. It contains promoters, UTRs, terminators, tags, reporters, antibiotic resistance genes, and introns cloned in various positions to allow maximum modularity. The toolkit enables rapid building of engineered cells for both fundamental research and algal biotechnology. This work will make Chlamydomonas the next chassis for sustainable synthetic biology.

Abstract An arsenal of effector proteins from plant pathogenic Phytophthora species manipulates their host from inside the cells. Phytophthora parasitica produces the effector AVH195 during an initial, biotrophic phase of infection. The protein transiently impairs plant immune-associated hypersensitive cell death in Nicotiana . ATG8 Interaction Motifs in the protein indicate that the effector targets the autophagic core machinery. We selected a photosynthetic microalga with a single copy ATG8 gene as an alternative model to dissect AVH195-induced autophagic perturbation. AVH195 slows down autophagic flux in Chlamydomonas reinhardtii thus promoting the accumulation of cargo-rich vesicles. In yeast, membrane-associated AVH195 interacts with ATG8 from Chlamydomonas and with different ATG8 isoforms from Arabidopsis thaliana . The overexpression of Avh195 in Arabidopsis promotes growth of both infecting P. parasitica and Hyaloperonospora arabidopsidis , an obligate biotroph. To our knowledge, this report provides first evidence that an oomycete effector non-selectively targets ATG8 in different organisms from the green lineage to slow down autophagic flux for infection.

Abstract Global photosynthesis consumes ten times more CO 2 than net anthropogenic emissions, and microalgae account for nearly half of this consumption 1 . The great efficiency of algal photosynthesis relies on a mechanism concentrating CO 2 (CCM) at the catalytic site of the carboxylating enzyme RuBisCO, thus enhancing CO 2 fixation 2 . While many cellular components involved in the transport and sequestration of inorganic carbon (C i ) have been uncovered 3,4 , the way microalgae supply energy to concentrate CO 2 against a thermodynamic gradient remains elusive 4-6 . Here, by monitoring dissolved CO 2 consumption, unidirectional O 2 exchange and the chlorophyll fluorescence parameter NPQ in the green alga Chlamydomonas , we show that the complementary effects of cyclic electron flow and O 2 photoreduction, respectively mediated by PGRL1 and flavodiiron proteins, generate the proton motive force ( pmf ) required by C i transport across thylakoid membranes. We demonstrate that the trans-thylakoid pmf is used by bestrophin-like C i transporters and further establish that a chloroplast-to-mitochondria electron flow contributes to energize non-thylakoid C i transporters, most likely by supplying ATP. We propose an integrated view of the CCM energy supply network, describing how algal cells distribute photosynthesis energy to power different C i transporters, thus paving the way to the transfer of a functional algal CCM in plants towards improving crop productivity. One sentence summary Photosynthetic alternative electron flows and mitochondrial respiration drive the algal CO 2 concentrating mechanism

ABSTRACT Photosynthetic organisms have developed sophisticated strategies to fine-tune light energy conversion to meet the metabolic demand, thereby optimizing growth in fluctuating light environments. Although mechanisms such as energy dissipation, photosynthetic control, or the photosystem II (PSII) damage and repair have been widely studied, little is known about the regulation of protein synthesis capacity during light acclimation. By screening a Chlamydomonas reinhardtii insertional mutant library using chlorophyll fluorescence imaging, we isolated a high chlorophyll fluorescence mutant ( hf 0 ) defected in a gene encoding a putative plastid targeted DEAD-box RNA helicase called CreRH22. CreRH22 is rapidly induced upon illumination and belongs to the GreenCut, a set of proteins specific to photosynthetic organisms. While photosynthesis is slightly affected in the mutant under low light (LL), exposure to high light (HL) induces a marked decrease in both PSII and PSI, and a strong alteration of the light-induced gene expression pattern. These effects are explained by the inability of hf 0 to increase plastid ribosome amounts under HL. We conclude that CreRH22, by promoting ribosomal RNA precursor maturation in a light-dependent manner, enables the assembly of extra-ribosomes required to synthesize photosystem subunits at a higher rate, a critical step in the acclimation of algae to HL.

Abstract Nitrogen (N) scarcity is a frequently encountered situation that constrains global biomass productivity. In response to N deficiency, cell division stops and photosynthetic electron transfer is downregulated, while carbon storage is enhanced. However, the molecular mechanism downregulating photosynthesis during N deficiency and its relationship with carbon storage are not fully understood. The Proton Gradient Regulator-like 1 (PGRL1) controlling cyclic electron flow (CEF) and Flavodiiron proteins involved in pseudo-(CEF) are major players in the acclimation of photosynthesis. To determine the role of PGRL1 or FLV in photosynthesis under N deficiency, we measured photosynthetic electron transfer, oxygen gas exchange and carbon storage in Chlamydomonas pgrl1 and flvB knockout mutants. Under N deficiency, pgrl1 maintains higher net photosynthesis and O 2 photoreduction rates, while flvB shows a similar response compared to control strains. Cytochrome b 6 f and PSI are maintained at a higher abundance in pgrl1 . The photosynthetic activity of flvB and pgrl1 flvB double mutants decreases in response to N deficiency similar to the control strains. Furthermore, the preservation of photosynthetic activity in pgrl1 is accompanied by an increased accumulation of triacylglycerol depending on the genetic background. Taken together, our results suggest that in the absence of PGRL1-controlled CEF, FLV-mediated PCEF maintains net photosynthesis at a high level and that CEF and PCEF play antagonistic roles during N deficiency. It further illustrates how nutrient status and genetic makeup of a strain can affect the regulation of photosynthetic energy conversion in relation to carbon storage and provides new strategies for improving lipid productivity in algae. Significance statement Nitrogen (N) deficiency, an often-encountered phenomenon in nature, results in growth arrest, downregulation of photosynthesis and massive carbon storage in microalgae. However, more mechanistic insights involved in tuning photosynthetic electron transfer during N deficiency are required. Here, we provide evidence that a well-conserved protein in chlorophytes, the Proton Gradient Regulator-like 1 (PGRL1), is a key regulator of photosynthesis during N deficiency. In its absence, cells exhibited sustained photosynthesis thanks to the Flavodiiron (FLV) proteins. We propose that both PGRL1 and FLV, by having antagonistic roles in N deficiency, manage the redox landscape, carbon storage and biomass production. Our work revolves around the current paradigm of photosynthesis regulation during N deficiency and provides a new framework for improving biomass production and carbon storage in microalgae for biotechnological purposes.

Abstract Nitrogen (N) scarcity frequently constrains global biomass productivity. N deficiency halts cell division, downregulates photosynthetic electron transfer, and enhances carbon storage. However, the molecular mechanism downregulating photosynthesis during N deficiency and its relationship with carbon storage are not fully understood. Proton Gradient Regulator-like 1 (PGRL1) controlling cyclic electron flow (CEF) and Flavodiiron proteins (FLV) involved in pseudo-CEF (PCEF) are major players in the acclimation of photosynthesis. To determine the role of PGRL1 or FLV in photosynthesis under N deficiency, we measured photosynthetic electron transfer, oxygen gas exchange, and carbon storage in Chlamydomonas reinhardtii pgrl1 and flvB knockout mutants. Under N deficiency, pgrl1 maintained higher net photosynthesis and O2 photoreduction rates and higher levels of Cytochrome b6f and PSI compared to the control and flvB. The photosynthetic activity of flvB and pgrl1 flvB double mutants decreased in response to N deficiency, similar to the control strains. Furthermore, the preservation of photosynthetic activity in pgrl1 was accompanied by an increased accumulation of triacylglycerol in certain genetic backgrounds but not others, highlighting the importance of gene-environment interaction in determining traits such as oil content. Our results suggest that in the absence of PGRL1-controlled CEF, FLV-mediated PCEF maintains net photosynthesis at a high level and that CEF and PCEF play antagonistic roles during N deficiency. They further illustrate how a strain's nutrient status and genetic makeup can affect regulation of photosynthetic energy conversion in relation to carbon storage and provide additional strategies for improving lipid productivity in algae.