SUMMARY The lung microvasculature is essential for gas exchange and commonly considered homogeneous. We show that Vascular endothelial growth factor A ( Vegfa ) from the epithelium specifies a distinct endothelial cell (EC) population in the postnatal mouse lung. Vegfa is predominantly expressed by alveolar type 1 (AT1) cells and locally required to specify a subset of ECs. Single cell RNA-seq identified 15-20% lung ECs as transcriptionally distinct and marked by Carbonic anhydrase 4 (Car4), which are specifically lost upon epithelial Vegfa deletion. Car4 ECs, unlike bulk ECs, have extensive cellular projections and are separated from AT1 cells by a limited basement membrane without intervening pericytes. Without Car4 ECs, the alveolar space is aberrantly enlarged despite the normal appearance of myofibroblasts. Lung Car4 ECs and retina tip ECs have common and distinct transcriptional profiles. These findings support a signaling role of AT1 cells and shed light on alveologenesis.

Abstract Previous work has elegantly demonstrated that, unlike adult mammalian heart, the neonatal heart is able to regenerate after injury from postnatal day (P) 1 to 7. Recently, macrophages are found to be required in the repair process as depletion of which abolishes endogenous regenerative capability of the neonatal heart. Nevertheless, whether innate immunity alone is sufficient for neonatal heart regeneration is obscure. Here, we investigate a hitherto novel role of FOXP3 + regulatory T-cells (Treg) in neonatal heart regeneration. Unlike their wild type counterparts, NOD/SCID mice that are deficient for T-cells but innate immune cells including macrophages fail to regenerate their injured heart as early as P3. In wild type mice, both conventional CD4 + T-cells and Treg are recruited to cardiac muscle within the first week after injury. Treatment with the lytic anti-CD4 antibody that specifically depletes conventional CD4 + T-cells leads to reduced cardiac fibrosis; while treatment with the lytic anti-CD25 antibody that specifically depletes CD4 + CD25 hi FOXP3 + Treg contributes to increased fibrosis of the neonatal heart after injury. Moreover, adoptive transfer of Treg to NOD/SCID mice results in mitigated fibrosis and increased proliferation and function of cardiac muscle of the neonatal heart after injury. Mechanistically, single cell transcriptomic profiling reveals that Treg are a source of chemokines and cytokines that attract monocytes and macrophages previously known to drive neonatal heart regeneration. Furthermore, Treg directly promote proliferation of both mouse and human cardiomyocytes in a paracrine manner. Our findings uncover an unappreciated mechanism in neonatal heart regeneration; and offer new avenues for developing novel therapeutics targeting Treg-mediated heart regeneration.

Abstract Local signals provided by cells in specialized niche microenvironments regulate stem cell behaviour in many different organs and species. In adult mammalian bone marrow (BM), leptin receptor-positive (LepR+) reticular cells express secreted factors that control the function of haematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). During fetal development, the developing skeletal system is colonized by c-Kit+ haematopoietic cells de novo after a transient phase of liver haematopoiesis. The cellular and molecular mechanisms regulating de novo haematopoietic cell colonization and expansion remain largely unknown. Here, we report that fetal and adult BM exhibit fundamental differences both in terms of cellular composition and molecular interactions by single cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. While LepR+ reticular cells are almost completely absent in fetal femur, arterial endothelial cells (AECs) are a source of signals controlling the initial HSPC expansion during BM development. Long-term haematopoietic stem cells (HSCs) and other c-Kit+ HSPCs are reduced when Wnt ligand secretion by AECs is genetically blocked. We identify Wnt2 as an AEC-derived signal that directly activates β-catenin dependent proliferation of fetal HSPCs. Treatment of HSPCs ex vivo with Wnt2 promotes their proliferation and improves engraftment in vivo after transplantation. Our work reveals a fundamental switch in the cellular organization and molecular regulation of BM niches in the embryonic and adult organism.

Abstract During the origin of great apes about 14 million years ago, a series of phenotypic innovations emerged, such as the increased body size, the enlarged brain volume, the improved cognitive skill and the diversified diet. Yet, the genomic basis of these evolutionary changes remains unclear. Utilizing the high-quality genome assemblies of great apes (including human), gibbon and macaque, we conducted comparative genome analyses, and identified 15,885 great-ape-specific structural variants (GSSVs), including 8 coding GSSVs resulting in the creation of novel proteins (e.g. ACAN and CMYA5 ). Functional annotations of the GSSV-related genes revealed the enrichment of genes involved development and morphogenesis, especially neurogenesis and neural network formation, suggesting the potential role of GSSVs in shaping the great-ape-shared traits. Further dissection of the brain-related GSSVs show great-ape-specific changes of enhancer activities and gene expression in the brain, involving a group of GSSV-regulated genes (such as NOL3 ) that potentially contribute to the altered brain development and function in great apes. The presented data highlights the evolutionary role of structural variants in the phenotypic innovations during the origin of the great lineage.

Abstract Many glandular epithelia are mainly composed of basal cells and luminal cells, including the prostate gland. Adult prostate basal and luminal cells are independently self-sustained by unipotent stem cells that can reactivate multipotency under prostate inflammation and carcinogenesis contexts. However, the defined basal stem cell populations responsible for prostate regeneration and their cell fates in prostate homeostasis, inflammation and carcinogenesis remain unclear. Using a genetic proliferation tracer (ProTracer) system, we found that basal cells exhibited extensive cell loss and proliferation during androgen-mediated prostate regression and regeneration, respectively. A rare intermediate basal cell population that expresses luminal cell markers ( Nkx3 . 1 and Pbsn ) (termed Basal-B) and a large basal cell population (termed Basal-A) were identified in mouse prostates by single-cell RNA sequencing. Basal-B cells exhibited a greater capacity for organoid formation and luminal cell differentiation in vitro . Genetic lineage tracing using dual recombinases showed that prostate homeostasis and regeneration are not driven by specific basal cell types. Fate-mapping results showed that Basal-B cells had a greater tendency to generate luminal cells under bacteria-induced prostate inflammation. Deletion of Pten in basal cells resulted in Basal-A-to-Basal-B-to-luminal transition and prostatic intraepithelial neoplasia. Moreover, the human Basal-B-cell population was significantly increased in human benign prostate hyperplasia and prostatic intraepithelial neoplasia samples compared with normal prostate samples. This study identifies intermediate Basal-B cells as a potential stem cell population and provides genetic evidence of prostate basal cell lineage plasticity under physiological and pathological contexts.

ABSTRACT Background Cardiac valve disease (CVD) is observed in 2.5% of the general population and 10% of the elderly people. Effective pharmacological treatments are currently not available, and patients with severe CVD require surgery. PROX1 and FOXC2 are transcription factors that are required for the development of lymphatic and venous valves. We found that PROX1 and FOXC2 are expressed in a subset of valvular endothelial cells (VECs) that are located on the downstream (fibrosa) side of cardiac valves. Whether PROX1 and FOXC2 regulate cardiac valve development and disease is not known. Methods We used histology, electron microscopy and echocardiography to investigate the structure and functioning of heart valves from Prox1 ΔVEC mice in which Prox1 was conditionally deleted from VECs. Isolated valve endothelial cells and valve interstitial cells were used to identify the molecular mechanisms in vitro , which were tested in vivo by RNAScope, additional mouse models and pharmacological approaches. The significance of our findings was tested by evaluation of human samples of mitral valve prolapse (MVP) and aortic valve insufficiency. Results Histological analysis revealed that the aortic and mitral valves of Prox1 ΔVEC mice become progressively thick and myxomatous. Echocardiography revealed that the aortic valves of Prox1 ΔVEC mice are stenotic. FOXC2 was downregulated and platelet-derived growth factor-B (PDGF-B) was upregulated in the VECs of Prox1 ΔVEC mice. Conditional knockdown of FOXC2 and conditional overexpression of PDGF-B in VECs recapitulated the phenotype of Prox1 ΔVEC mice. PDGF-B was also increased in mice lacking FOXC2 and in human MVP and insufficient aortic valve samples. Pharmacological inhibition of PDGF-B signaling with imatinib partially ameliorated the valve defects of Prox1 ΔVEC mice. Conclusion PROX1 antagonizes PDGF-B signaling partially via FOXC2 to maintain the extracellular matrix composition and prevent myxomatous degeneration of cardiac valves. Novelty and Significance What Is Known? The transcription factors PROX1 and FOXC2 are critical regulators of lymphatic and venous valve development. PROX1 and FOXC2 are expressed in the downstream valvular endothelial cells of heart valves. What Is New? Deletion of Prox1 from the valvular endothelial cells of mice results in enlarged and myxomatous aortic and mitral valves. Aortic valves of the mutant ( Prox1 ΔVEC ) mice were stenotic. FOXC2 is partially responsible for the phenotype of Prox1 ΔVEC mice. PROX1 and FOXC2 inhibit the expression of the cytokine PDGF-B in heart valves. Hyperactivation of PDGF-B signaling results in aortic and mitral valve thickening. Inhibition of PDGF-B signaling ameliorates aortic valve stenosis in Prox1 ΔVEC mice. PDGFB is overexpressed and PROX1 is downregulated in human mitral valve prolapse (MVP) samples. Our findings suggest that PROX1 is an inhibitor of myxomatous valve disease that afflicts ~10% of the elderly population. We have also identified PDGF-B as a potential target for treating myxomatous valve disease.

Ubiquitously expressed cytoplasmic adaptors CRK and CRKL mediate multiple signaling pathways in mammalian embryogenesis. They are also associated with cardiovascular defects occurring in Miller-Dieker syndrome and 22q11.2 deletion syndrome, respectively. The embryonic mesoderm contributes to the formation of the cardiovascular system, yet the roles that Crk and Crkl play there are not understood on a single cell level.To determine functions of Crk and Crkl in the embryonic mesoderm during early mouse vascular development. Secondly, we will examine the molecular mechanisms responsible for early embryonic endothelial cell (EC) defects by performing single cell RNA-sequencing (scRNA-seq) and in vivo validation experiments.Inactivation of both Crk and Crkl together using Mesp1 Cre resulted embryonic lethality with severe vascular defects. Although vasculogenesis appeared normal, angiogenesis was disrupted both in the yolk sac and embryo proper, leading to disorganized vascular networks. We performed scRNA-seq of the Mesp1 Cre mesodermal lineage and found that there was upregulation of a great number of angiogenesis and cell migration related genes in ECs in the mutants, including NOTCH signaling genes such as Dll4 and Hey1 . Further bioinformatic analysis of EC subpopulations identified a relative increase in the number of more differentiated angiogenic ECs and decrease in EC progenitors. Consistent with this, we identified an expansion of Dll4 expressing cells within abnormal arteries, in vivo . Also, our bioinformatic data indicates that there is dysregulated expression of lineage genes that promote EC differentiation causing accelerated cell fate progression during EC differentiation.Our results show that Crk and Crkl are crucial for regulating early embryonic angiogenesis. Combined inactivation of Crk/Crkl caused precocious EC maturation with an increase of atypical differentiated angiogenic ECs and failed vascular remodeling. This is in part due to increased NOTCH signaling and altered expression of cell migration genes.

Cardiac looping is an early morphogenic process critical for the formation of four-chambered mammalian hearts. To study the roles of signaling pathways, transcription factors (TFs) and genetic networks in the process, we constructed gene co-expression networks and identified gene modules highly activated in individual cardiomyocytes (CMs) at multiple anatomical regions and developmental stages. Function analyses of the module genes uncovered major pathways important for spatiotemporal CM differentiation. Interestingly, about half of the pathways were highly active in cardiomyocytes at outflow tract (OFT) and atrioventricular canal (AVC), including many well-known signaling pathways for cardiac development and several newly identified ones. Most of the OFT-AVC pathways were predicted to be regulated by 66 transcription factors (TFs) actively expressed at the OFT-AVC locations, with the prediction supported by motif enrichment analysis of the TF targets, including 10 TFs that have not been previously associated with cardiac development, e.g., Etv5, Rbpms, and Baz2b. Finally, our study showed that the OFT-AVC TF targets were significantly enriched with genes associated with mouse heart developmental abnormalities and human congenital heart defects.

Intestinal stem cell propagation and differentiation are essential for rapid repair of tissue damage in the gut. While intestinal stromal cells were recently identified as key mediators of this process, the cellular and molecular mechanisms by which this diverse population induces tissue repair remains poorly understood. Here we show that Map3k2 has a colon stromal cell specific function critically required for maintenance of Lgr5+ intestinal stem cells and protection against acute intestinal damage. This Map3k2 -specific function is mediated by enhancing Wnt agonist R-spondin1 production. We further reveal a unique novel cell population, named Map3k2 -regulated intestinal stromal cells (MRISC), as the primary cellular source of R-spondin1 following intestinal injury. Together, our data identify a novel intestinal stem cell niche organized by MRISC, which specifically dependent on the Map3k2 -signaling pathway to augment the production of Wnt agonist R-spondin1 and promote regeneration of the acutely damaged intestine.Highlights 1. Map3k2 protects mice from DSS-induced colitis by promoting intestinal stem cell regeneration.2. Map3k2 -MAPK pathway cross-talks with Wnt signaling pathway via upregulation of R-spondin1.3. Map3k2 - R egulated I ntestinal S tromal C ells (MRISC) marked by co-expression of CD90, CD34 and CD81 defines a novel colonic stem cell niche.

SUMMARY Identification of novel regional skeletal stem cells (SSCs) will provide a new cellular paradigm for bone physiology and dysfunction. Several populations of SSCs have been identified at distinct skeletal sites. However, a bona fide SSC population has not yet been formally characterized in the bone marrow. Here, we identify a metaphyseal SSCs (mpSSCs) population whose transcriptional landscape is distinct from other bone mesenchymal stromal cells (bMSCs) in the bone marrow. These mpSSCs emerge at the postnatal stage and reside just underneath the growth plate, consistent with the fact that these mpSSCs are exclusively derived from hypertrophic chondrocytes (HCs). These mpSSCs possess SSC properties such as self-renewal and multipotency in vitro and in vivo , stand at the top of the HC de-differentiation path, and produce most HC progeny. Genetic block of the conversion from HCs to mpSSCs significantly compromises trabecular bone formation and bone regeneration. Thus, metaphysis houses a unique HC-derived SSC population, which is a major source of osteoblasts and bMSCs supporting postnatal trabecular bone formation.