ABSTRACT Gas clathrates are both a resource and a hindrance. They store massive quantities of natural gas but also can clog natural gas pipelines, with disastrous consequences. Eco-friendly technologies for controlling and modulating gas clathrate growth are needed. Type I Antifreeze Proteins (AFPs) from cold-water fish have been shown to bind to gas clathrates via repeating motifs of threonine and alanine. We tested whether proteins encoded in the genomes of bacteria native to natural gas clathrates bind to and alter clathrate morphology. We identified putative clathrate-binding proteins (CBPs) with multiple threonine/alanine motifs in a putative operon ( cbp ) in metagenomes from natural clathrate deposits. We recombinantly expressed and purified five CbpA proteins, four of which were stable, and experimentally confirmed that CbpAs bound to tetrahydrofuran (THF) clathrate, a low-pressure analog for structure II gas clathrate. When grown in the presence of CbpAs, THF clathrate was polycrystalline and plate-like instead of forming single, octahedral crystals. Two CbpAs yielded branching clathrate crystals, similar to the effect of Type I AFP, while the other two produced hexagonal crystals parallel to the [1 1 1] plane, suggesting two distinct binding modes. Bacterial CBPs may find future utility in industry, such as maintaining a plate-like structure during gas clathrate transportation. Table of Contents Graphic

Gas hydrates harbor gigatons of natural gas, yet their microbiomes remain mysterious. We bioprospected methane hydrate-bearing sediments from under Hydrate Ridge (offshore Oregon, USA, ODP Site 1244) using 16S rRNA gene amplicon, metagenomic, and metaproteomic analysis. Atribacteria (JS-1 Genus 1) sequences rose in abundance with increasing sediment depth. We characterized the most complete JS-1 Genus 1 metagenome-assembled genomic bin (B2) from the deepest sample, 69 meters below the seafloor (E10-H5), within the gas hydrate stability zone. B2 harbors functions not previously reported for Atribacteria, including a primitive respiratory complex and myriad capabilities to survive extreme conditions (e.g. high salt brines, high pressure, and cold temperatures). Several Atribacteria traits, such as a hydrogenase-Na+/H+ antiporter supercomplex (Hun) and di-myo-inositol-phosphate (DIP) synthesis, were similar to those from hyperthermophilic archaea. Expressed Atribacteria proteins were involved in transport of branched chain amino acids and carboxylic acids. Transporter genes were downstream from a novel helix-turn-helix transcriptional regulator, AtiR, which was not present in Atribacteria from other sites. Overall, Atribacteria appear to be endowed with unique strategies that may contribute to its dominance in methane-hydrate bearing sediments. Active microbial transport of amino and carboxylic acids in the gas hydrate stability zone may influence gas hydrate stability.

Marine oxygen deficient zones (ODZs) are portions of the ocean where intense nitrogen loss occurs primarily via denitrification and anammox. Despite many decades of study, the identity of the microbes that catalyze nitrogen loss in ODZs are still being elucidated. Intriguingly, high transcription of genes in the same family as nitric oxide dismutase from Methylomirabilota have been reported in the anoxic core of ODZs. Here, we show that the most abundantly transcribed nod genes in the Eastern Tropical North Pacific ODZ belong to Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria), rather than Methylomirabilota as previously assumed. Gammaproteobacteria and Planctomycetia also transcribe nod, but at lower relative abundance than Rhodospirillaceae in the upper ODZ. The Rhodospirillaceae are likely methylotrophs that oxidize methanol as a source of electrons for aerobic respiration; additional electrons may come from sulfide oxidation. Molecular oxygen for aerobic respiration may originate from nitric oxide dismutation via cryptic oxygen cycling. The Rhodospirillaceae also transcribe multiheme cytochrome (here named ptd) genes for a putative porin-cytochrome protein complex of unknown function, potentially involved in extracellular reduction electron transfer. Our results implicate Rhodospirillaceae as a significant player in marine nitrogen loss and highlight its potential in one-carbon, nitrogen, and sulfur metabolism in ODZs.

Divalent metal cations are essential to the structure and function of the ribosome. Previous characterizations of the ribosome performed under standard laboratory conditions have implicated Mg2+ as a primary mediator of ribosomal structure and function. Possible contributions of Fe2+ as a ribosomal cofactor have been largely overlooked, despite the ribosome's early evolution in a high Fe2+ environment, and its continued use by obligate anaerobes inhabiting high Fe2+ niches. Here we show that (i) Fe2+ cleaves RNA by in-line cleavage, a non-oxidative mechanism that has not been detected previously for this metal, (ii) the first-order rate constant with respect to divalent cations is hundreds of times greater with Fe2+ than with Mg2+, (iii) functional ribosomes are associated with Fe2+ after purification from cells grown under low O2 and high Fe2+, and (iv) a small fraction of Fe2+ that is associated with the ribosome is not exchangeable with surrounding divalent cations, presumably because it is tightly coordinated by rRNA and buried in the ribosome. In total, these results expand the ancient role of iron in biochemistry, suggest a novel method for regulation of translation by iron, and highlight a possible new mechanism of iron toxicity.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract The Great Oxidation Event (GOE) was a rapid accumulation of oxygen in the atmosphere as a result of the photosynthetic activity of cyanobacteria. This accumulation reflected the pervasiveness of O 2 on the planet’s surface, indicating that cyanobacteria had become ecologically successful in Archean oceans. Micromolar concentrations of Fe 2+ in Archean oceans would have reacted with hydrogen peroxide, a byproduct of oxygenic photosynthesis, to produce hydroxyl radicals, which cause cellular damage. Yet cyanobacteria colonized Archean oceans extensively enough to oxygenate the atmosphere, which likely required protection mechanisms against the negative impacts of hydroxyl radical production in Fe 2+ -rich seas. We identify several factors that could have acted to protect early cyanobacteria from the impacts of hydroxyl radical production and hypothesize that microbial cooperation may have played an important role in protecting cyanobacteria from Fe 2+ toxicity before the GOE. We found that several strains of facultative anaerobic heterotrophic bacteria ( Shewanella ) with ROS defense mechanisms increase the fitness of cyanobacteria ( Synechococcus ) in ferruginous waters. Shewanella species with manganese transporters provided the most protection. Our results suggest that a tightly regulated response to prevent Fe 2+ toxicity could have been important for the colonization of ancient ferruginous oceans, particularly in the presence of high manganese concentrations, and may expand the upper bound for tolerable Fe 2+ concentrations for cyanobacteria.

Abstract Magnesium, the most abundant divalent cation in cells, catalyzes RNA cleavage but also promotes RNA folding. Because folding can protect RNA from cleavage, we predicted a “Goldilocks peak”, which is a local maximum in RNA lifetime at the Mg 2+ concentration required for folding. Here we use simulation and experiment to discover an innate yet sophisticated mechanism of control of RNA lifetime. By simulation we characterized the RNA Goldilocks peak and its dependence on cleavage parameters and extent of folding. Supporting experiments with yeast tRNA Phe and Tetrahymena ribozyme P4-P6 domains show that structured RNA can inhabit a Goldilocks peak in vitro . The Goldilocks peaks are tunable by differences in cleavage rate constants, Mg 2+ binding cooperativity, and Mg 2+ affinity. Broad ranges of those folding and cleavage parameters produce Goldilocks peaks of different intensities. Goldilocks behavior allows ultrafine control of RNA chemical lifetime, whereas non-folding RNAs do not display a Goldilocks peak. In sum, the effects of Mg 2+ on RNA persistence are expected to be pleomorphic, both protecting and degrading RNA. In evolutionary context, Goldilocks behavior may have shaped RNA in an early Earth environment containing Mg 2+ and other metals.