The establishment of the anteroposterior (AP) axis is a crucial step during animal embryo development. In mammals, genetic studies have shown that this process relies on signals spatiotemporally deployed in the extra-embryonic tissues that locate the position of the head and the onset of gastrulation, marked by T/Brachyury (

Generation of asymmetry within the early embryo is a critical step in the establishment of the three body axes, providing a reference for the patterning of the organism. To study the establishment of asymmetry and the development of the anteroposterior axis (AP) in culture, we utilised our Gastruloid model system. Gastruloids, highly reproducible embryonic organoids formed from aggregates of mouse embryonic stem cells, display symmetry-breaking, polarised gene expression and axial development, mirroring the processes on a time-scale similar to that of the mouse embyro. Using Gastruloids formed from mouse ESCs containing reporters for Wnt, FGF and Nodal signalling, we were able to quantitatively assess the contribution of these signalling pathways to the establishment of asymmetry through single time-point and live-cell fluorescence microscopy. During the first 24-48h of culture, interactions between the Wnt/β-Catenin and Nodal/TGFβ signalling pathways promote the initial symmetry-breaking event, manifested through polarised Brachyury (T/Bra) expression. Neither BMP nor FGF signalling is required for the establishment of asymmetry, however Wnt signalling is essential for the amplification and stability of the initial patterning event. Additionally, low, endogenous levels of FGF (24-48h) has a role in the amplification of the established pattern at later time-points. Our results confirm that Gastruloids behave like epiblast cells in the embryo, leading us to translate the processes and signalling involved in pattern formation of Gastruloids in culture to the development of the embryo, firmly establishing Gastruloids as a highly reproducible, robust model system for studying cell fate decisions and early pattern formation in culture.

Establishment of the three body axes is a critical step during animal development. In mammals, genetic studies have shown that a combination of precisely deployed signals from extraembryonic tissues position the anteroposterior axis (AP) within the embryo and lead to the emergence of the dorsoventral (DV) and left-right (LR) axes. We have used Gastruloids, embryonic organoids, as a model system to understand this process and find that they are able to develop AP, DV and LR axes as well as to undergo axial elongation in a manner that mirror embryos. The Gastruloids can be grown for 160 hours and form derivatives from ectoderm, mesoderm and endoderm. We focus on the AP axis and show that in the Gastruloids this axis is registered in the expression of T/Bra at one pole that corresponds to the tip of the elongation. We find that localisation of T/Bra expression depends on the combined activities of Wnt/β-Catenin and Nodal/Smad2,3 signalling, and that BMP signalling is dispensable for this process. Furthermore, AP axis specification occurs in the absence of both extraembryonic tissues and of localised sources of signalling. Our experiments show that Nodal, together with Wnt/β-Catenin signalling, is essential for the expression of T/Bra but that Wnt signalling has a separable activity in the elongation of the axis. The results lead us to suggest that, in the embryo, the role of the extraembryonic tissues might not be to induce the axes but to bias an intrinsic ability of the embryo to break its initial symmetry and organise its axes.

MicroRNAs (miRNAs) are short, nonprotein‐coding RNAs, and their expression is dysregulated in malignant germ cell tumors (GCTs). Here, we investigated the causes and consequences of downregulated miR‐99a‐5p/miR‐100‐5p (functionally identical) and miR‐125b‐5p levels in malignant GCTs regardless of age, site, or subtype. Quantitative RT‐PCR was used to assess miR‐99a‐5p/miR‐100‐5p, miR‐125b‐5p, and associated gene expression in malignant GCT tissues/cell lines [seminoma (Sem), yolk sac tumor (YST), embryonal carcinoma (EC)]. Cells were treated with demethylating 5‐azacytidine and pyrosequencing was performed. Combination miR‐100‐5p/miR‐125b‐5p mimic replenishment was used to treat malignant GCT cells. Global messenger RNA (mRNA) targets of the replenished miRNAs were identified and Metascape used to study pathway effects. We found that expression levels of miR‐99a‐5p/miR‐100‐5p and miR‐125b‐5p, their respective pri‐miRNAs, and associated genes from chromosomes 11 and 21 (chr11/chr21) were downregulated and highly correlated in malignant GCT cells. Treatment with 5‐azacytidine caused upregulation of these miRNAs, with pyrosequencing revealing hypermethylation of their chr11/chr21 loci, likely contributing to miR‐100‐5p/miR‐125b‐5p downregulation. Combination miR‐100‐5p/miR‐125b‐5p mimic replenishment resulted in growth inhibition in Sem/YST cells, with miR‐100‐5p/miR‐125b‐5p mRNA targets enriched in downregulated genes, which were involved in cell cycle (confirmed by flow cytometry) and signaling pathways. Knockdown of the miR‐100‐5p/miR‐125b‐5p target tripartite motif containing 71 ( TRIM71 kd) recapitulated miR‐100‐5p/miR‐125b‐5p replenishment, with growth inhibition and cell cycle disruption of Sem/YST/EC cells. Further, replenishment led to reduced lin‐28 homolog A ( LIN28A ) levels and concomitant increases in let‐7 ( MIRLET7B ) tumor suppressor miRNAs, creating a sustained reversion of cell phenotype. In summary, combination miR‐100‐5p/miR‐125b‐5p mimic replenishment or TRIM71 kd caused growth inhibition in malignant GCT cells via cell cycle disruption. Further studies are now warranted, including mimic treatment alongside conventional platinum‐based chemotherapy.