Plant microRNAs (miRNAs) affect only a small number of targets with high sequence complementarity, while animal miRNAs usually have hundreds of targets with limited complementarity. We used artificial miRNAs (amiRNAs) to determine whether the narrow action spectrum of natural plant miRNAs reflects only intrinsic properties of the plant miRNA machinery or whether it is also due to past selection against natural miRNAs with broader specificity. amiRNAs were designed to target individual genes or groups of endogenous genes. Like natural miRNAs, they had varying numbers of target mismatches. Previously determined parameters of target selection for natural miRNAs could accurately predict direct targets of amiRNAs. The specificity of amiRNAs, as deduced from genome-wide expression profiling, was as high as that of natural plant miRNAs, supporting the notion that extensive base pairing with targets is required for plant miRNA function. amiRNAs make an effective tool for specific gene silencing in plants, especially when several related, but not identical, target genes need to be downregulated. We demonstrate that amiRNAs are also active when expressed under tissue-specific or inducible promoters, with limited nonautonomous effects. The design principles for amiRNAs have been generalized and integrated into a Web-based tool (http://wmd.weigelworld.org).

To take complete advantage of information on within-species polymorphism and divergence from close relatives, one needs to know the rate and the molecular spectrum of spontaneous mutations. To this end, we have searched for de novo spontaneous mutations in the complete nuclear genomes of five Arabidopsis thaliana mutation accumulation lines that had been maintained by single-seed descent for 30 generations. We identified and validated 99 base substitutions and 17 small and large insertions and deletions. Our results imply a spontaneous mutation rate of 7 x 10(-9) base substitutions per site per generation, the majority of which are G:C-->A:T transitions. We explain this very biased spectrum of base substitution mutations as a result of two main processes: deamination of methylated cytosines and ultraviolet light-induced mutagenesis.

The genomes of individuals from the same species vary in sequence as a result of different evolutionary processes. To examine the patterns of, and the forces shaping, sequence variation in Arabidopsis thaliana , we performed high-density array resequencing of 20 diverse strains (accessions). More than 1 million nonredundant single-nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified at moderate false discovery rates (FDRs), and ∼4% of the genome was identified as being highly dissimilar or deleted relative to the reference genome sequence. Patterns of polymorphism are highly nonrandom among gene families, with genes mediating interaction with the biotic environment having exceptional polymorphism levels. At the chromosomal scale, regional variation in polymorphism was readily apparent. A scan for recent selective sweeps revealed several candidate regions, including a notable example in which almost all variation was removed in a 500-kilobase window. Analyzing the polymorphisms we describe in larger sets of accessions will enable a detailed understanding of forces shaping population-wide sequence variation in A. thaliana .

Several endogenous and environmental factors need to be integrated to time the onset of flowering [1Ausin I. Alonso-Blanco C. Martinez-Zapater J.M. Environmental regulation of flowering.Int. J. Dev. Biol. 2005; 49: 689-705Crossref PubMed Scopus (135) Google Scholar, 2Baurle I. Dean C. The timing of developmental transitions in plants.Cell. 2006; 125: 655-664Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (439) Google Scholar, 3Corbesier L. Coupland G. The quest for florigen: a review of recent progress.J. Exp. Bot. 2006; 57: 3395-3403Crossref PubMed Scopus (153) Google Scholar]. Genetic and molecular analyses, primarily in Arabidopsis thaliana and rice, have shown that CONSTANS (CO) and FLOWERING LOCUS T (FT) play central roles in photoperiod-dependent flowering [4Putterill J. Robson F. Lee K. Simon R. Coupland G. The CONSTANS gene of Arabidopsis promotes flowering and encodes a protein showing similarities to zinc finger transcription factors.Cell. 1995; 80: 847-857Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (986) Google Scholar, 5Kardailsky I. Shukla V.K. Ahn J.H. Dagenais N. Christensen S.K. Nguyen J.T. Chory J. Harrison M.J. Weigel D. Activation tagging of the floral inducer FT.Science. 1999; 286: 1962-1965Crossref PubMed Scopus (1053) Google Scholar, 6Kobayashi Y. Kaya H. Goto K. Iwabuchi M. Araki T. A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals.Science. 1999; 286: 1960-1962Crossref PubMed Scopus (966) Google Scholar, 7Yano M. Katayose Y. Ashikari M. Yamanouchi U. Monna L. Fuse T. Baba T. Yamamoto K. Umehara Y. Nagamura Y. et al.Hd1, a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS.Plant Cell. 2000; 12: 2473-2484PubMed Google Scholar, 8Suarez-Lopez P. Wheatley K. Robson F. Onouchi H. Valverde F. Coupland G. CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis.Nature. 2001; 410: 1116-1120Crossref PubMed Scopus (970) Google Scholar, 9Kojima S. Takahashi Y. Kobayashi Y. Monna L. Sasaki T. Araki T. Yano M. Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions.Plant Cell Physiol. 2002; 43: 1096-1105Crossref PubMed Scopus (784) Google Scholar, 10Yanovsky M.J. Kay S.A. Molecular basis of seasonal time measurement in Arabidopsis.Nature. 2002; 419: 308-312Crossref PubMed Scopus (514) Google Scholar, 11Yanovsky M.J. Kay S.A. Living by the calendar: how plants know when to flower.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003; 4: 265-275Crossref PubMed Scopus (225) Google Scholar, 12Hayama R. Coupland G. The molecular basis of diversity in the photoperiodic flowering responses of Arabidopsis and rice.Plant Physiol. 2004; 135: 677-684Crossref PubMed Scopus (235) Google Scholar, 13Valverde F. Mouradov A. Soppe W. Ravenscroft D. Samach A. Coupland G. Photoreceptor regulation of CONSTANS protein in photoperiodic flowering.Science. 2004; 303: 1003-1006Crossref PubMed Scopus (838) Google Scholar]. The overall picture is that CO acts in the phloem companion cells of leaves and that its main effect is to induce FT mRNA in these cells [11Yanovsky M.J. Kay S.A. Living by the calendar: how plants know when to flower.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003; 4: 265-275Crossref PubMed Scopus (225) Google Scholar, 12Hayama R. Coupland G. The molecular basis of diversity in the photoperiodic flowering responses of Arabidopsis and rice.Plant Physiol. 2004; 135: 677-684Crossref PubMed Scopus (235) Google Scholar, 14Izawa T. Oikawa T. Sugiyama N. Tanisaka T. Yano M. Shimamoto K. Phytochrome mediates the external light signal to repress FT orthologs in photoperiodic flowering of rice.Genes Dev. 2002; 16: 2006-2020Crossref PubMed Scopus (296) Google Scholar, 15Takada S. Goto K. Terminal flower2, an Arabidopsis homolog of heterochromatin protein1, counteracts the activation of FLOWERING LOCUS T by CONSTANS in the vascular tissues of leaves to regulate flowering time.Plant Cell. 2003; 15: 2856-2865Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar, 16An H. Roussot C. Suarez-Lopez P. Corbesier L. Vincent C. Pineiro M. Hepworth S. Mouradov A. Justin S. Turnbull C. et al.CONSTANS acts in the phloem to regulate a systemic signal that induces photoperiodic flowering of Arabidopsis.Development. 2004; 131: 3615-3626Crossref PubMed Scopus (479) Google Scholar, 17Abe M. Kobayashi Y. Yamamoto S. Daimon Y. Yamaguchi A. Ikeda Y. Ichinoki H. Notaguchi M. Goto K. Araki T. FD, a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex.Science. 2005; 309: 1052-1056Crossref PubMed Scopus (965) Google Scholar, 18Wigge P.A. Kim M.C. Jaeger K.E. Busch W. Schmid M. Lohmann J.U. Weigel D. Integration of spatial and temporal information during floral induction in Arabidopsis.Science. 2005; 309: 1056-1059Crossref PubMed Scopus (966) Google Scholar, 19Ahn J.H. Miller D. Winter V.J. Banfield M.J. Lee J.H. Yoo S.Y. Henz S.R. Brady R.L. Weigel D. A divergent external loop confers antagonistic activity on floral regulators FT and TFL1.EMBO J. 2006; 25: 605-614Crossref PubMed Scopus (329) Google Scholar]. Surprisingly, FT, a small globular protein of 20 kDa, interacts at the shoot apex with the bZIP transcription factor FLOWERING LOCUS D (FD) to induce downstream targets [17Abe M. Kobayashi Y. Yamamoto S. Daimon Y. Yamaguchi A. Ikeda Y. Ichinoki H. Notaguchi M. Goto K. Araki T. FD, a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex.Science. 2005; 309: 1052-1056Crossref PubMed Scopus (965) Google Scholar, 18Wigge P.A. Kim M.C. Jaeger K.E. Busch W. Schmid M. Lohmann J.U. Weigel D. Integration of spatial and temporal information during floral induction in Arabidopsis.Science. 2005; 309: 1056-1059Crossref PubMed Scopus (966) Google Scholar]. Given that green fluorescent protein (GFP), which as a monomer is 27 kDa, can be easily exported to sink tissue including flowers when expressed in phloem companion cells, the latter finding strongly implied that FT protein is the mobile floral-inductive signal [17Abe M. Kobayashi Y. Yamamoto S. Daimon Y. Yamaguchi A. Ikeda Y. Ichinoki H. Notaguchi M. Goto K. Araki T. FD, a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex.Science. 2005; 309: 1052-1056Crossref PubMed Scopus (965) Google Scholar, 18Wigge P.A. Kim M.C. Jaeger K.E. Busch W. Schmid M. Lohmann J.U. Weigel D. Integration of spatial and temporal information during floral induction in Arabidopsis.Science. 2005; 309: 1056-1059Crossref PubMed Scopus (966) Google Scholar, 19Ahn J.H. Miller D. Winter V.J. Banfield M.J. Lee J.H. Yoo S.Y. Henz S.R. Brady R.L. Weigel D. A divergent external loop confers antagonistic activity on floral regulators FT and TFL1.EMBO J. 2006; 25: 605-614Crossref PubMed Scopus (329) Google Scholar]. In agreement with this hypothesis, an FT-GFP fusion, just like GFP, can be exported from the phloem of both rice and Arabidopsis[20Corbesier L. Vincent C. Jang S. Fornara F. Fan Q. Searle I. Giakountis A. Farrona S. Gissot L. Turnbull C. et al.FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis.Science. 2007; (Published online April 19, 2007)https://doi.org/10.1126/science.114752Crossref PubMed Google Scholar, 21Tamaki S. Matsuo S. Wong H.L. Yokoi S. Shimamoto K. Hd3a protein is a mobile flowering signal in rice.Science. 2007; (Published online April 19, 2007)https://doi.org/10.1126/science.114753Crossref PubMed Google Scholar]. It has been unknown, however, whether mobile FT protein is sufficient for transmitting the flowering signal. Here we show that FT mRNA is required in phloem companion cells where it acts partially redundant with its paralog TWIN SISTER OF FT (TSF) to induce flowering. Furthermore, we have devised a method that uncouples FT mRNA and protein effects in vivo. We demonstrate that export of FT protein from phloem companion cells is sufficient to induce flowering.

Epistatic interactions between genes are a major factor in evolution. Hybrid necrosis is an example of a deleterious phenotype caused by epistatic interactions that is observed in many intra- and interspecific plant hybrids. A large number of hybrid necrosis cases share phenotypic similarities, suggesting a common underlying mechanism across a wide range of plant species. Here, we report that approximately 2% of intraspecific crosses in Arabidopsis thaliana yield F1 progeny that express necrosis when grown under conditions typical of their natural habitats. We show that several independent cases result from epistatic interactions that trigger autoimmune-like responses. In at least one case, an allele of an NB-LRR disease resistance gene homolog is both necessary and sufficient for the induction of hybrid necrosis, when combined with a specific allele at a second locus. The A. thaliana cases provide insights into the molecular causes of hybrid necrosis, and serve as a model for further investigation of intra- and interspecific incompatibilities caused by a simple epistatic interaction. Moreover, our finding that plant immune-system genes are involved in hybrid necrosis suggests that selective pressures related to host–pathogen conflict might cause the evolution of gene flow barriers in plants.

Whole-genome hybridization studies have suggested that the nuclear genomes of accessions (natural strains) of Arabidopsis thaliana can differ by several percent of their sequence. To examine this variation, and as a first step in the 1001 Genomes Project for this species, we produced 15- to 25-fold coverage in Illumina sequencing-by-synthesis (SBS) reads for the reference accession, Col-0, and two divergent strains, Bur-0 and Tsu-1. We aligned reads to the reference genome sequence to assess data quality metrics and to detect polymorphisms. Alignments revealed 823,325 unique single nucleotide polymorphisms (SNPs) and 79,961 unique 1- to 3-bp indels in the divergent accessions at a specificity of >99%, and over 2000 potential errors in the reference genome sequence. We also identified >3.4 Mb of the Bur-0 and Tsu-1 genomes as being either extremely dissimilar, deleted, or duplicated relative to the reference genome. To obtain sequences for these regions, we incorporated the Velvet assembler into a targeted de novo assembly method. This approach yielded 10,921 high-confidence contigs that were anchored to flanking sequences and harbored indels as large as 641 bp. Our methods are broadly applicable for polymorphism discovery in moderate to large genomes even at highly diverged loci, and we established by subsampling the Illumina SBS coverage depth required to inform a broad range of functional and evolutionary studies. Our pipeline for aligning reads and predicting SNPs and indels, SHORE, is available for download at http://1001genomes.org .

Summary

 Many microRNAs (miRNAs) are encoded by small gene families. In a third of all conserved Arabidopsis miRNA families, members vary at two or more nucleotide positions. We have focused on the related miR159 and miR319 families, which share sequence identity at 17 of 21 nucleotides, yet affect different developmental processes through distinct targets. MiR159 regulates MYB mRNAs, while miR319 predominantly acts on TCP mRNAs. In the case of miR319, MYB targeting plays at most a minor role because miR319 expression levels and domain limit its ability to affect MYB mRNAs. In contrast, in the case of miR159, the miRNA sequence prevents effective TCP targeting. We complement these observations by identifying nucleotide positions relevant for miRNA activity with mutants recovered from a suppressor screen. Together, our findings reveal that functional specialization of miR159 and miR319 is achieved through both expression and sequence differences.

The population structure of an organism reflects its evolutionary history and influences its evolutionary trajectory. It constrains the combination of genetic diversity and reveals patterns of past gene flow. Understanding it is a prerequisite for detecting genomic regions under selection, predicting the effect of population disturbances, or modeling gene flow. This paper examines the detailed global population structure of Arabidopsis thaliana. Using a set of 5,707 plants collected from around the globe and genotyped at 149 SNPs, we show that while A. thaliana as a species self-fertilizes 97% of the time, there is considerable variation among local groups. This level of outcrossing greatly limits observed heterozygosity but is sufficient to generate considerable local haplotypic diversity. We also find that in its native Eurasian range A. thaliana exhibits continuous isolation by distance at every geographic scale without natural breaks corresponding to classical notions of populations. By contrast, in North America, where it exists as an exotic species, A. thaliana exhibits little or no population structure at a continental scale but local isolation by distance that extends hundreds of km. This suggests a pattern for the development of isolation by distance that can establish itself shortly after an organism fills a new habitat range. It also raises questions about the general applicability of many standard population genetics models. Any model based on discrete clusters of interchangeable individuals will be an uneasy fit to organisms like A. thaliana which exhibit continuous isolation by distance on many scales.

Endogenous microRNAs (miRNAs) are potent negative regulators of gene expression in plants and animals. Artificial miRNAs (amiRNAs)-designed to target one or several genes of interest-provide a new and highly specific approach for effective post-transcriptional gene silencing (PTGS) in plants.We devised an amiRNA-based strategy for both japonica and indica type strains of cultivated rice, Oryza sativa. Using an endogenous rice miRNA precursor and customized 21mers, we designed amiRNA constructs targeting three different genes (Pds, Spl11, and Eui1/CYP714D1). Upon constitutive expression of these amiRNAs in the varieties Nipponbare (japonica) and IR64 (indica), the targeted genes are down-regulated by amiRNA-guided cleavage of the transcripts, resulting in the expected mutant phenotypes. The effects are highly specific to the target gene, the transgenes are stably inherited and they remain effective in the progeny.Our results not only show that amiRNAs can efficiently trigger gene silencing in a monocot crop, but also that amiRNAs can effectively modulate agronomically important traits in varieties used in modern breeding programs. We provide all software tools and a protocol for the design of rice amiRNA constructs, which can be easily adapted to other crops. The approach is suited for candidate gene validation, comparative functional genomics between different varieties, and for improvement of agronomic performance and nutritional value.

We present whole-genome assemblies of four divergent Arabidopsis thaliana strains that complement the 125-Mb reference genome sequence released a decade ago. Using a newly developed reference-guided approach, we assembled large contigs from 9 to 42 Gb of Illumina short-read data from the Landsberg erecta (L er -1), C24, Bur-0, and Kro-0 strains, which have been sequenced as part of the 1,001 Genomes Project for this species. Using alignments against the reference sequence, we first reduced the complexity of the de novo assembly and later integrated reads without similarity to the reference sequence. As an example, half of the noncentromeric C24 genome was covered by scaffolds that are longer than 260 kb, with a maximum of 2.2 Mb. Moreover, over 96% of the reference genome was covered by the reference-guided assembly, compared with only 87% with a complete de novo assembly. Comparisons with 2 Mb of dideoxy sequence reveal that the per-base error rate of the reference-guided assemblies was below 1 in 10,000. Our assemblies provide a detailed, genomewide picture of large-scale differences between A. thaliana individuals, most of which are difficult to access with alignment-consensus methods only. We demonstrate their practical relevance in studying the expression differences of polymorphic genes and show how the analysis of sRNA sequencing data can lead to erroneous conclusions if aligned against the reference genome alone. Genome assemblies, raw reads, and further information are accessible through http://1001genomes.org/projects/assemblies.html .