Thyroid hormones are well known to regulate whole-body energy metabolism, which was believed to occur as a direct effect on individual cells in the periphery. But Antonio Vidal-Puig and his colleagues now show that these thyroid hormone effects on energy regulation are actually indirect, as they regulate AMPK activity in the hypothalamus and thus central signaling to brown adipose tissue in the periphery. Thyroid hormones have widespread cellular effects; however it is unclear whether their effects on the central nervous system (CNS) contribute to global energy balance. Here we demonstrate that either whole-body hyperthyroidism or central administration of triiodothyronine (T3) decreases the activity of hypothalamic AMP-activated protein kinase (AMPK), increases sympathetic nervous system (SNS) activity and upregulates thermogenic markers in brown adipose tissue (BAT). Inhibition of the lipogenic pathway in the ventromedial nucleus of the hypothalamus (VMH) prevents CNS-mediated activation of BAT by thyroid hormone and reverses the weight loss associated with hyperthyroidism. Similarly, inhibition of thyroid hormone receptors in the VMH reverses the weight loss associated with hyperthyroidism. This regulatory mechanism depends on AMPK inactivation, as genetic inhibition of this enzyme in the VMH of euthyroid rats induces feeding-independent weight loss and increases expression of thermogenic markers in BAT. These effects are reversed by pharmacological blockade of the SNS. Thus, thyroid hormone–induced modulation of AMPK activity and lipid metabolism in the hypothalamus is a major regulator of whole-body energy homeostasis.

The gut microbiota has recently been identified as an environmental factor that may promote metabolic diseases. To investigate the effect of gut microbiota on host energy and lipid metabolism, we compared the serum metabolome and the lipidomes of serum, adipose tissue, and liver of conventionally raised (CONV-R) and germ-free mice. The serum metabolome of CONV-R mice was characterized by increased levels of energy metabolites, e.g., pyruvic acid, citric acid, fumaric acid, and malic acid, while levels of cholesterol and fatty acids were reduced. We also showed that the microbiota modified a number of lipid species in the serum, adipose tissue, and liver, with its greatest effect on triglyceride and phosphatidylcholine species. Triglyceride levels were lower in serum but higher in adipose tissue and liver of CONV-R mice, consistent with increased lipid clearance. Our findings show that the gut microbiota affects both host energy and lipid metabolism and highlights its role in the development of metabolic diseases. The gut microbiota has recently been identified as an environmental factor that may promote metabolic diseases. To investigate the effect of gut microbiota on host energy and lipid metabolism, we compared the serum metabolome and the lipidomes of serum, adipose tissue, and liver of conventionally raised (CONV-R) and germ-free mice. The serum metabolome of CONV-R mice was characterized by increased levels of energy metabolites, e.g., pyruvic acid, citric acid, fumaric acid, and malic acid, while levels of cholesterol and fatty acids were reduced. We also showed that the microbiota modified a number of lipid species in the serum, adipose tissue, and liver, with its greatest effect on triglyceride and phosphatidylcholine species. Triglyceride levels were lower in serum but higher in adipose tissue and liver of CONV-R mice, consistent with increased lipid clearance. Our findings show that the gut microbiota affects both host energy and lipid metabolism and highlights its role in the development of metabolic diseases. The mammalian gut microbiota is a complex and dynamic ecosystem (1Eckburg P.B. Bik E.M. Bernstein C.N. Purdom E. Dethlefsen L. Sargent M. Gill S.R. Nelson K.E. Relman D.A. Diversity of the human intestinal microbial flora.Science. 2005; 308: 1635-1638Crossref PubMed Scopus (5393) Google Scholar, 2Ley R.E. Backhed F. Turnbaugh P. Lozupone C.A. Knight R.D. Gordon J.I. Obesity alters gut microbial ecology.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 11070-11075Crossref PubMed Scopus (4208) Google Scholar, 3Ley R.E. Turnbaugh P.J. Klein S. Gordon J.I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity.Nature. 2006; 444: 1022-1023Crossref PubMed Scopus (5940) Google Scholar, 4Dethlefsen L. Huse S. Sogin M.L. Relman D.A. The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing.PLoS Biol. 2008; 6: e280Crossref PubMed Scopus (1688) Google Scholar) that has coevolved with its host (5Ley R.E. Hamady M. Lozupone C. Turnbaugh P.J. Ramey R.R. Bircher J.S. Schlegel M.L. Tucker T.A. Schrenzel M.D. Knight R. et al.Evolution of mammals and their gut microbes.Science. 2008; 320: 1647-1651Crossref PubMed Scopus (2344) Google Scholar). It has developed metabolic traits that complement the host's metabolism (6Hooper L.V. Wong M.H. Thelin A. Hansson L. Falk P.G. Gordon J.I. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.Science. 2001; 291: 881-884Crossref PubMed Scopus (1666) Google Scholar, 7Rawls J.F. Mahowald M.A. Ley R.E. Gordon J.I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection.Cell. 2006; 127: 423-433Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (667) Google Scholar, 8Li M. Wang B. Zhang M. Rantalainen M. Wang S. Zhou H. Zhang Y. Shen J. Pang X. Wei H. et al.Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 2117-2122Crossref PubMed Scopus (850) Google Scholar) and can thus be regarded as a metabolically active organ located within the mammalian gastrointestinal tract (9Hooper L.V. Midtvedt T. Gordon J.I. How host-­microbial interactions shape the nutrient environment of the mammalian intestine.Annu. Rev. Nutr. 2002; 22: 283-307Crossref PubMed Scopus (1159) Google Scholar, 10O'Hara A.M. Shanahan F. The gut flora as a forgotten organ.EMBO Rep. 2006; 7: 688-693Crossref PubMed Scopus (1794) Google Scholar). Studies comparing ileal tissue from germ-free (GF) and Bacteroidetes thetaiotaomicron-colonized mice have shown that microbial colonization modifies the expression of genes involved in the metabolism of xenobiotics (foreign compounds) as well as in host nutrient (amino acids, lipids, vitamins, and ions) absorption and processing (6Hooper L.V. Wong M.H. Thelin A. Hansson L. Falk P.G. Gordon J.I. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.Science. 2001; 291: 881-884Crossref PubMed Scopus (1666) Google Scholar).Evidence is now accumulating to indicate that perturbations of gut microbiota composition/functions may play an important role in the development of diseases associated with altered metabolism (11Bäckhed F. Ley R.E. Sonnenburg J.L. Peterson D.A. Gordon J.I. Host-bacterial mutualism in the human intestine.Science. 2005; 307: 1915-1920Crossref PubMed Scopus (3533) Google Scholar, 12Smith K. McCoy K.D. Macpherson A.J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota.Semin. Immunol. 2007; 19: 59-69Crossref PubMed Scopus (512) Google Scholar). The diversity of the gut microbiota in both mice and humans is low on the phylum level, where the majority of species (>95%) belong to Firmicutes and Bacteroidetes (1Eckburg P.B. Bik E.M. Bernstein C.N. Purdom E. Dethlefsen L. Sargent M. Gill S.R. Nelson K.E. Relman D.A. Diversity of the human intestinal microbial flora.Science. 2005; 308: 1635-1638Crossref PubMed Scopus (5393) Google Scholar, 2Ley R.E. Backhed F. Turnbaugh P. Lozupone C.A. Knight R.D. Gordon J.I. Obesity alters gut microbial ecology.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 11070-11075Crossref PubMed Scopus (4208) Google Scholar, 13Turnbaugh P.J. Hamady M. Yatsunenko T. Cantarel B.L. Duncan A. Ley R.E. Sogin M.L. Jones W.J. Roe B.A. Affourtit J.P. et al.A core gut microbiome in obese and lean twins.Nature. 2009; 457: 480-484Crossref PubMed Scopus (5412) Google Scholar). In contrast, the microbial diversity on species levels is very high (1Eckburg P.B. Bik E.M. Bernstein C.N. Purdom E. Dethlefsen L. Sargent M. Gill S.R. Nelson K.E. Relman D.A. Diversity of the human intestinal microbial flora.Science. 2005; 308: 1635-1638Crossref PubMed Scopus (5393) Google Scholar, 2Ley R.E. Backhed F. Turnbaugh P. Lozupone C.A. Knight R.D. Gordon J.I. Obesity alters gut microbial ecology.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 11070-11075Crossref PubMed Scopus (4208) Google Scholar, 13Turnbaugh P.J. Hamady M. Yatsunenko T. Cantarel B.L. Duncan A. Ley R.E. Sogin M.L. Jones W.J. Roe B.A. Affourtit J.P. et al.A core gut microbiome in obese and lean twins.Nature. 2009; 457: 480-484Crossref PubMed Scopus (5412) Google Scholar). Recent studies in both mice and humans demonstrated that obesity is associated with an altered gut microbial ecology, exemplified by lower microbial diversity and decreased levels of Bacteroidetes (2Ley R.E. Backhed F. Turnbaugh P. Lozupone C.A. Knight R.D. Gordon J.I. Obesity alters gut microbial ecology.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 11070-11075Crossref PubMed Scopus (4208) Google Scholar, 3Ley R.E. Turnbaugh P.J. Klein S. Gordon J.I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity.Nature. 2006; 444: 1022-1023Crossref PubMed Scopus (5940) Google Scholar, 13Turnbaugh P.J. Hamady M. Yatsunenko T. Cantarel B.L. Duncan A. Ley R.E. Sogin M.L. Jones W.J. Roe B.A. Affourtit J.P. et al.A core gut microbiome in obese and lean twins.Nature. 2009; 457: 480-484Crossref PubMed Scopus (5412) Google Scholar, 14Turnbaugh P.J. Backhed F. Fulton L. Gordon J.I. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome.Cell Host Microbe. 2008; 3: 213-223Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2029) Google Scholar). The shift in microbial composition is associated with alterations in the gut microbial metagenome, notably an enrichment of genes involved in energy harvest (15Turnbaugh P.J. Ley R.E. Mahowald M.A. Magrini V. Mardis E.R. Gordon J.I. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.Nature. 2006; 444: 1027-1031Crossref PubMed Scopus (7887) Google Scholar). Furthermore, GF mice have decreased adiposity and hepatic triglyceride levels compared with conventionally raised (CONV-R) mice and are resistant to diet-induced obesity (16Bäckhed F. Ding H. Wang T. Hooper L.V. Koh G.Y. Nagy A. Semenkovich C.F. Gordon J.I. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101: 15718-15723Crossref PubMed Scopus (4181) Google Scholar, 17Bäckhed F. Manchester J.K. Semenkovich C.F. Gordon J.I. Mechanisms underlying the resistance to diet-induced obesity in germ-free mice.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104: 979-984Crossref PubMed Scopus (1864) Google Scholar). Although the mechanisms through which the gut microbiota promotes obesity have not been clarified in detail, it is known that GF mice have increased fatty acid oxidation and decreased lipogenesis (16Bäckhed F. Ding H. Wang T. Hooper L.V. Koh G.Y. Nagy A. Semenkovich C.F. Gordon J.I. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101: 15718-15723Crossref PubMed Scopus (4181) Google Scholar, 17Bäckhed F. Manchester J.K. Semenkovich C.F. Gordon J.I. Mechanisms underlying the resistance to diet-induced obesity in germ-free mice.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104: 979-984Crossref PubMed Scopus (1864) Google Scholar).Novel approaches are now emerging to measure and model metabolism. A powerful approach to understand host metabolism is to produce multivariate phenotypic signatures such as metabolite profiles (metabolomics). Metabolomics of plasma from GF and CONV-R mice have begun to reveal a profound microbial effect of host metabolism, especially on amino acid metabolites (18Claus S.P. Tsang T.M. Wang Y. Cloarec O. Skordi E. Martin F-P. Rezzi S. Ross A. Kochhar S. Holmes E. et al.Systemic multicompartmental effects of the gut microbiome on mouse metabolic phenotypes.Mol. Syst. Biol. 2008; 4: 219Crossref PubMed Scopus (269) Google Scholar, 19Wikoff W.R. Anfora A.T. Liu J. Schultz P.G. Lesley S.A. Peters E.C. Siuzdak G. Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood metabolites.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 3698-3703Crossref PubMed Scopus (1729) Google Scholar). For example, the gut microbiota is required for the production of bioactive indole-containing metabolites, such as the antioxidant indole-3-propionic acid, from tryptophan (19Wikoff W.R. Anfora A.T. Liu J. Schultz P.G. Lesley S.A. Peters E.C. Siuzdak G. Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood metabolites.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 3698-3703Crossref PubMed Scopus (1729) Google Scholar). Despite our increased understanding of how microbes affect the host metabolome (8Li M. Wang B. Zhang M. Rantalainen M. Wang S. Zhou H. Zhang Y. Shen J. Pang X. Wei H. et al.Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 2117-2122Crossref PubMed Scopus (850) Google Scholar, 18Claus S.P. Tsang T.M. Wang Y. Cloarec O. Skordi E. Martin F-P. Rezzi S. Ross A. Kochhar S. Holmes E. et al.Systemic multicompartmental effects of the gut microbiome on mouse metabolic phenotypes.Mol. Syst. Biol. 2008; 4: 219Crossref PubMed Scopus (269) Google Scholar, 19Wikoff W.R. Anfora A.T. Liu J. Schultz P.G. Lesley S.A. Peters E.C. Siuzdak G. Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood metabolites.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 3698-3703Crossref PubMed Scopus (1729) Google Scholar, 20Martin F.P. Dumas M.E. Wang Y. Legido-Quigley C. Yap I.K. Tang H. Zirah S. Murphy G.M. Cloarec O. Lindon J.C. et al.A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model.Mol. Syst. Biol. 2007; 3: 112Crossref PubMed Scopus (398) Google Scholar, 21Martin F.P. Wang Y. Sprenger N. Yap I.K. Lundstedt T. Lek P. Rezzi S. Ramadan Z. van Bladeren P. Fay L.B. et al.Probiotic modulation of symbiotic gut microbial-host metabolic interactions in a humanized microbiome mouse model.Mol. Syst. Biol. 2008; 4: 157Crossref PubMed Scopus (338) Google Scholar, 22Martin F.P. Wang Y. Sprenger N. Yap I.K. Rezzi S. Ramadan Z. Pere-Trepat E. Rochat F. Cherbut C. van Bladeren P. et al.Top-down systems biology integration of conditional prebiotic modulated transgenomic interactions in a humanized microbiome mouse model.Mol. Syst. Biol. 2008; 4: 205Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar), our knowledge of microbial modulation of host energy and lipid metabolism is limited. In particular, it is not clear how the gut microbiota affects the systemic lipid metabolism in metabolically important organs such as adipose tissue and liver. Given the complexity of systemic lipid metabolism (23Smith L.C. Pownall H.J. Gotto A.M. The plasma lipoproteins: structure and metabolism.Annu. Rev. Biochem. 1978; 47: 751-777Crossref PubMed Scopus (187) Google Scholar), it is clear that a multi-tissue approach is needed to clarify these issues.Here, we use MS-based metabolomics of serum in combination with MS-based lipidomics of serum, white adipose tissue, and liver of GF and CONV-R mice to delineate how the gut microbiota affects the host's energy and lipid metabolism. We show that the presence of a gut microbiota is reflected by increased levels of pyruvic acid and tricarboxylic acid metabolites in serum. Furthermore, we observed altered lipid metabolism in serum, white adipose tissue, and liver, with the most notable effects on triglyceride and phosphatidylcholine species.MATERIALS AND METHODSAnimalsMale GF Swiss Webster mice (aged 12–14 weeks) were maintained in flexible plastic film isolators under a strict 12-h-light cycle (lights on at 06:00 h). Sterility was routinely confirmed by culturing and PCR analysis from feces using universal primers amplifying the 16S rRNA gene. Age-matched male CONV-R Swiss Webster mice were transferred to identical isolators at weaning. Both groups of mice were fed an autoclaved chow diet (Labdiet, St. Louis, MO) ad libitum unless otherwise stated. To produce conventionalized (CONV-D) mice, we conventionalized 12-week-old GF mice with gut microbiota from Swiss Webster donor mice as previously described (16Bäckhed F. Ding H. Wang T. Hooper L.V. Koh G.Y. Nagy A. Semenkovich C.F. Gordon J.I. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101: 15718-15723Crossref PubMed Scopus (4181) Google Scholar). The study protocols were approved by the University of Gothenburg Animal Studies Committee.Blood was collected from the vena cava under deep isoflurane anesthesia after a 4 h fast, unless otherwise stated, and the mice were subsequently euthanized by cervical dislocation. The liver and epididymal white adipose tissues were immediately removed and snap frozen in liquid nitrogen.Metabolomic analyses using GC coupled to time-of-flight MS platformSerum samples (30 µl) were combined with 10 µl of an internal standard, labeled palmitic acid (16:0-16,16,16d3; 500 mg/l), and 400 µl of methanol, vortexed for 2 min, and incubated for 30 min at room temperature. The supernatant was separated by centrifugation at 5,590 g for 5 min at room temperature. The sample was dried under constant flow of nitrogen. Twenty-five microliters of 2% methoxyamine hydrochloride in pyridine was added to the dried sample and incubated at 45°C for 1 h and then derivatized with 25 µl of N-methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide by incubating at 45°C for 1 h. Five microliters of retention index standard mixture with five alkanes (400 mg/l) was added to the metabolite mixture. Sample order for analysis was established by randomization. The samples were analyzed on a Leco Pegasus 4D GC coupled to time-of-flight MS (GCxGC-ToF/MS) mass spectrometer with Agilent technologies 6890N GC and Combi PAL autosampler.The metabolites were identified using an in-house reference compound library and by searching the reference mass spectral library. Mass spectra from the GCxGC-TOF/MS analysis were searched against the Palisade Complete Mass Spectral Library, 600K Edition (Palisade Mass Spectrometry, Ithaca, NY), which includes all spectra available from the NIST 2002 and Wiley registry collections and 150,000 other spectra. The matches to reference spectra are based on a weighted dot product of the two spectra, with higher m/z peaks having more weight than the lower. A similarity value is assigned between 0 and 999, with 999 being a perfect match and 750 generally considered as a reasonable match. We used the conservative cutoff criterion of 850 for identification.Lipidomic analyses using ultra performance liquid chromatography/MS platformSerum (10 µl) and liver samples (5–10 mg) were diluted with 0.9% NaCl (10 µl for serum, 50 µl for liver) and adipose tissue samples (5–10 mg) were diluted with 200 µl PBS buffer. All samples were spiked with an internal standard (10 µl for serum and liver, 20 µl for adipose) (24Laaksonen R. Katajamaa M. Paiva H. Sysi-Aho M. Saarinen L. Junni P. Lutjohann D. Smet J. Van Coster R. Seppanen-Laakso T. et al.A systems biology strategy reveals biological pathways and plasma biomarker candidates for potentially toxic statin-­induced changes in muscle.PLoS One. 2006; 1: e97Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar). The samples were subsequently extracted with chloroform-methanol (2:1) solvent (100 µl for serum, 200 µl for liver, 400 µl with 40 µl of PBS buffer for adipose), homogenized with a glass rod (serum) or a Retsch homogenizer (Mixer MILL type MM301) for 2 min at 25 Hz (liver) or 20 Hz (adipose) at 4°C by adding two zirconium oxide grinding balls, vortexed (1 min for serum, 2 min for liver and adipose), incubated at room temperature (1 h for serum and adipose, 30 min for liver), and centrifuged at 5,590 g for 3 min. From the separated lower phase, an aliquot (60 µl for serum, 100 µl for liver, 200 µl for adipose) was mixed with a labeled standard mixture (three stable isotope-labeled reference compounds; 10 μl for serum and liver, 20 µl for adipose) and 0.5–1.0 μl injection was used for LC/MS analysis. Sample order for analysis was established by randomization. Lipid extracts were analyzed on a Q-ToF Premier mass spectrometer (Waters) combined with an Acquity ultra performance liquid chromatography/MS (for specific settings, see Supplementary Methods).ModelingTo include the correlation structure of lipidomics data into the analysis and therefore explore possible associations between different lipid molecular species, we applied the partial least squares discriminant analysis (PLS/DA) (25Geladi P. Kowalski B.R. Partial least-squares regression: a tutorial.Anal. Chim. Acta. 1986; 185: 1-17Crossref Scopus (5565) Google Scholar, 26Barker M. Rayens W. Partial least squares for discrimination.J. Chemometr. 2003; 17: 166-173Crossref Scopus (1958) Google Scholar) using the SIMPLS algorithm to calculate the model (27de Jong S. SIMPLS: an alternative approach to partial least squares regression.Chemom. Intell. Lab. Syst. 1993; 18: 251-263Crossref Scopus (1403) Google Scholar). PLS/DA is a common approach to multivariate metabolomics data analysis (28Pears M.R. Cooper J.D. Mitchison H.M. Mortishire-Smith R.J. Pearce D.A. Griffin J.L. High resolution 1H NMR-based metabolomics indicates a neurotransmitter cycling deficit in cerebral tissue from a mouse model of Batten Disease.J. Biol. Chem. 2005; 280: 42508-42514Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (128) Google Scholar, 29Brindle J.T. Antti H. Holmes E. Tranter G. Nicholson J.K. Bethell H.W.L. Clarke S. Schofield P.M. McKilligin E. Mosedale D.E. et al.Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H-NMR-based metabonomics.Nat. Med. 2002; 8: 1439-1445Crossref PubMed Google Scholar). PLS/DA analysis maximizes the product of variance matrix of measured variables (e.g., lipidomic profile data) and correlation of measured data with properties of interest (e.g., CONV-R vs. GF mice). PLS/DA makes latent variables of original matrix X (predictor variable, e.g., lipidomics data) and matrix Y (response variable; e.g., mouse groups). Latent variables are formed as a linear combination of all the original variables in X in such a way that most of the association with Y variables can be explained together with the variation in X. Contiguous-blocks cross-validation method and Q2 scores were used to develop the models (30Wise B.M. Gallagher N.B. Bro R. Shaver J.M. Windig W. Koch J.S. PLS Toolbox 4.0 for Use with Matlab. Eigenvector Research Inc, Manson, WA2006Google Scholar). Q2 indicates how accurately the data, either classed or nonclassed, can be predicted, and this term is more relevant to supervised pattern recognition processes. Q2 scores over 0.08 indicate a model that is better than chance, whereas a score between 0.7 and 1.0 demonstrates a highly robust trend. For each model built, the loading scores and the variable importance on projection (VIP) parameters were examined, in conjunction with the original data, to identify which metabolites contributed most to clusterings or a trend observed in the data. Loading scores describe the correlation between the original variables and the new component variables, whereas VIP parameters are essentially a measure of the degree to which a particular variable explains the Y variance (class membership). PLS/DA analyses were performed using Matlab, version 7.5 (Mathworks, Natick, MA) and PLS Toolbox, version 4.2, of the Matlab package (Eigenvector Research, Wenatchee, WA).Measurements of serum lipidsTotal serum triglycerides and cholesterol were analyzed according to the manufacturer's protocols (Thermo Electron, Grenoble, France). The lipid distribution in plasma lipoprotein fractions was assessed by fast protein liquid chromatography gel filtration with a Superose 6 HR 10/30 column (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Each fraction was subsequently analyzed for tri­glyceride or cholesterol content as above. Plasma lipoproteins were also separated by agarose gel electrophoresis (31Young S.G. Bertics S.J. Curtiss L.K. Witztum J.L. Characterization of an abnormal species of apolipoprotein B, apolipoprotein B-37, associated with familial hypobetalipoproteinemia.J. Clin. Invest. 1987; 79: 1831-1841Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar) and the chylomicron staining was quantified by densitometry.Hepatic VLDL productionTo determine the VLDL production rate, lipolysis was blocked by injecting mice with 12.5 mg of Triton WR1339 (10% solution in saline) intravenously after an overnight fast. Blood samples were drawn from the tail vein at 0, 10, 30, 60, and 90 min after injection. Triglycerides were measured using an enzymatic color­imetric assay (Thermo Electron, Grenoble, France) according to the manufacturer's protocol.Administration of lipid bolusMice were gavaged with 400 µl heavy whipping cream (36% fat, Arla, Sweden) after an overnight fast and euthanized 1 or 4 h after the lipid bolus. Serum was collected and triglycerides were measured as above.StatisticsStudent's t-test was applied to test for pairwise differences between the means, single factor ANOVA was applied to test for differences among means, and Dunn-Sidák multiple comparison procedure was applied to identify which means were significantly different, using the multcompare function of the MATLAB Statistical Toolbox. P values < 0.05 were considered as statistically significant. False Discovery Rate or the expected proportion of false discoveries among the rejected hypotheses was estimated using the method by Benjamini et al. (32Benjamini Y. Drai D. Elmer G. Kafkafi N. Golani I. Controlling the false discovery rate in behavior genetics research.Behav. Brain Res. 2001; 125: 279-284Crossref PubMed Scopus (2644) Google Scholar). The adjusted P values (q-values) were calculated with the function “p.adjust” using the R statistical software (http://www.r-project.org/).RESULTSThe gut microbiota affects the serum metabolomeWe performed MS-based metabolic profiling of serum from CONV-R and GF Swiss Webster mice after a 4 h fast by using two-dimensional GC coupled to time-of-flight MS (GCxGC-ToF/MS) and identified 185 metabolites. Modeling and clustering by PLS/DA revealed that serum metabolite profiles clustered according to colonization status (Fig. 1A, corresponding VIP values are listed in supplementary Table I, and all 29 metabolites that are significantly altered in CONV-R compared with GF mice are listed in supplementary Table II).As expected, we observed increased levels of the microbially derived metabolites and metabolites involved in xenobiotic metabolism in serum from CONV-R mice (Fig. 1B). 3-Hydroxyphenylpropionic acid, a product of catechin metabolism (33Bazzocco S. Mattila I. Guyot S. Renard C. Aura A-M. Factors affecting the conversion of apple polyphenols to phenolic acids and fruit matrix to short-chain fatty acids by human faecal microbiota in vitro.Eur. J. Nutr. 2008; 47: 442-452Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar), and hydrocinnamic acid (or benzenepropanoic acid), which is produced by clostridium species (34Moss C.W. Lambert M.A. Goldsmith D.J. Production of hydrocinnamic acid by clostridia.Appl. Microbiol. 1970; 19: 375-378Crossref PubMed Google Scholar), were elevated in CONV-R mice. In addition, we observed increases in rhamnose, a component of the outer cell membrane of acid-fast bacteria in the mycobacterium genus (35Tashjian Jr., A.H. Armstrong E.J. Galanter J.N. Armstrong A.W. Arnaout R.A. Rose H.S. Pharmacology of the bacterial cell wall.in: Golan D.E. In Principles of Pharmacology: The Pathophysiologic Basis of Drug Therapy. Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore2005: 569Google Scholar) (Fig. 1B). These findings demonstrate that the host serum metabolite profile reflects microbial metabolism in the intestine. Serum levels of glucuronic acid, which is associated with phase II (conjugation) metabolism of xenobiotic compounds (36Tukey R.H. Strassburg C.P. Human UDP-glucurono­syltransferases: metabolism, expression, and disease.Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2000; 40: 581-616Crossref PubMed Scopus (1277) Google Scholar), were also increased in CONV-R mice compared with CONV-R mice (Fig. 1B). This increase is consistent with increased ex­­pression of Ugt2b38 in the liver (R. Hezaveh, C. Reigstad, P. Gopalacharyulu, M. Oresic, F. Bäckhed, unpublished data).The gut microbiota also promoted increases in the serum levels of pyruvic acid and the tricarboxylic acid metabolites citric acid, fumaric acid, and mails acid (all metabolites involved in energy metabolism) and reduced serum levels of urea and the urea cycle metabolite l-ornithine (Fig. 1B). Serum levels of several essential cellular building blocks, including sugars, amino acids, and fatty acids, were also modified. In particular, serum from CONV-R mice had decreased levels of long-chain fatty acids [the saturated fatty acid palmitic acid (16:0) and the unsaturated essential fatty acid linoleic acid (18:2n-6)] and cholesterol, and increased levels of the dietary phytosterol campesterol and glucose (Fig. 1B). We also identified increased serum levels of the monoamine ne­urotransmitters dopamine and tyramine and of trans- 2-aminomethylcyclopropanecarboxylic acid, a cyclopro­pane analog of γ-aminobutyric acid, in CONV-R mice (Fig. 1B).The gut microbiota affects the serum lipidomeTo investigate in further detail how the gut microbiota affects the serum lipidome, we performed high-resolution lipidomics of serum from CONV-R and GF mice after a 4 h fast using ultra performance liquid chromatography/MS. This technology allows several hundred lipid species to be simultaneously and accurately analyzed (24Laaksonen R. Katajamaa M. Paiva H. Sysi-Aho M. Saarinen L. Junni P. Lutjohann D. Smet J. Van Coster R. Seppanen-Laakso T. et al.A systems biology strategy reveals biological pathways and plasma biomarker candidates for potentially toxic statin-­induced changes in muscle.PLoS One. 2006; 1: e97Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar). We identified and quantified 333 lipids in serum from CONV-R and GF mice, and PLS/DA modeling and clustering revealed significant differences in the global serum lipid profiles between CONV-R and GF mice (Fig. 2A; corresponding VIP values are listed in supplementary Table III, and all significantly altered lipid species are listed in supplementary Table IV).Fig. 2Serum lipidomic profiles in CONV-R compared with GF mice. A: PLS/DA of serum lipids from GF (n = 8) and CONV-R (n = 5) mice after a 4 h fast. Scores for latent variable LV1 and sample are depicted. Regression coefficients and VIP scores for the top ranked lipids are listed in supplementary Table III. B-E: Absolute concentrations of the most abundant cholesteryl esters (ChoE), sphingomyelins (SM), phosphatidylcholines (PC), and triglycerides (TG) in serum from GF and CONV-R mice. For a complete list of microbially altered serum lipids, see supplementary Table IV. Data are expressed as mean values ± SEM. ∗ P < 0.05; ∗∗ P < 0.01; and ∗∗∗ P < 0.001 compared with GF mice.View Large Image Fi

OBJECTIVE Obesity-associated insulin resistance is characterized by a state of chronic, low-grade inflammation that is associated with the accumulation of M1 proinflammatory macrophages in adipose tissue. Although different evidence explains the mechanisms linking the expansion of adipose tissue and adipose tissue macrophage (ATM) polarization, in the current study we investigated the concept of lipid-induced toxicity as the pathogenic link that could explain the trigger of this response. RESEARCH DESIGN AND METHODS We addressed this question using isolated ATMs and adipocytes from genetic and diet-induced murine models of obesity. Through transcriptomic and lipidomic analysis, we created a model integrating transcript and lipid species networks simultaneously occurring in adipocytes and ATMs and their reversibility by thiazolidinedione treatment. RESULTS We show that polarization of ATMs is associated with lipid accumulation and the consequent formation of foam cell–like cells in adipose tissue. Our study reveals that early stages of adipose tissue expansion are characterized by M2-polarized ATMs and that progressive lipid accumulation within ATMs heralds the M1 polarization, a macrophage phenotype associated with severe obesity and insulin resistance. Furthermore, rosiglitazone treatment, which promotes redistribution of lipids toward adipocytes and extends the M2 ATM polarization state, prevents the lipid alterations associated with M1 ATM polarization. CONCLUSIONS Our data indicate that the M1 ATM polarization in obesity might be a macrophage-specific manifestation of a more general lipotoxic pathogenic mechanism. This indicates that strategies to optimize fat deposition and repartitioning toward adipocytes might improve insulin sensitivity by preventing ATM lipotoxicity and M1 polarization.

Abstract Nutrient availability is the major regulator of life and reproduction, and a complex cellular signaling network has evolved to adapt organisms to fasting. These sensor pathways monitor cellular energy metabolism, especially mitochondrial ATP production and NAD + / NADH ratio, as major signals for nutritional state. We hypothesized that these signals would be modified by mitochondrial respiratory chain disease, because of inefficient NADH utilization and ATP production. Oral administration of nicotinamide riboside ( NR ), a vitamin B3 and NAD + precursor, was previously shown to boost NAD + levels in mice and to induce mitochondrial biogenesis. Here, we treated mitochondrial myopathy mice with NR . This vitamin effectively delayed early‐ and late‐stage disease progression, by robustly inducing mitochondrial biogenesis in skeletal muscle and brown adipose tissue, preventing mitochondrial ultrastructure abnormalities and mt DNA deletion formation. NR further stimulated mitochondrial unfolded protein response, suggesting its protective role in mitochondrial disease. These results indicate that NR and strategies boosting NAD + levels are a promising treatment strategy for mitochondrial myopathy.

Summary

 Mitochondrial dysfunction elicits various stress responses in different model systems, but how these responses relate to each other and contribute to mitochondrial disease has remained unclear. Mitochondrial myopathy (MM) is the most common manifestation of adult-onset mitochondrial disease and shows a multifaceted tissue-specific stress response: (1) transcriptional response, including metabolic cytokines FGF21 and GDF15; (2) remodeling of one-carbon metabolism; and (3) mitochondrial unfolded protein response. We show that these processes are part of one integrated mitochondrial stress response (ISRmt), which is controlled by mTORC1 in muscle. mTORC1 inhibition by rapamycin downregulated all components of ISRmt, improved all MM hallmarks, and reversed the progression of even late-stage MM, without inducing mitochondrial biogenesis. Our evidence suggests that (1) chronic upregulation of anabolic pathways contributes to MM progression, (2) long-term induction of ISRmt is not protective for muscle, and (3) rapamycin treatment trials should be considered for adult-type MM with raised FGF21.

We sought to determine whether adipose tissue is inflamed in individuals with increased liver fat (LFAT) independently of obesity.A total of 20 nondiabetic, healthy, obese women were divided into normal and high LFAT groups based on their median LFAT level (2.3 +/- 0.3 vs. 14.4 +/- 2.9%). Surgical subcutaneous adipose tissue biopsies were studied using quantitative PCR, immunohistochemistry, and a lipidomics approach to search for putative mediators of insulin resistance and inflammation. The groups were matched for age and BMI. The high LFAT group had increased insulin (P = 0.0025) and lower HDL cholesterol (P = 0.02) concentrations.Expression levels of the macrophage marker CD68, the chemokines monocyte chemoattractant protein-1 and macrophage inflammatory protein-1alpha, and plasminogen activator inhibitor-1 were significantly increased, and those of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and adiponectin decreased in the high LFAT group. CD68 expression correlated with the number of macrophages and crown-like structures (multiple macrophages fused around dead adipocytes). Concentrations of 154 lipid species in adipose tissue revealed several differences between the groups, with the most striking being increased concentrations of triacylglycerols, particularly long chain, and ceramides, specifically Cer(d18:1/24:1) (P = 0.01), in the high LFAT group. Expression of sphingomyelinases SMPD1 and SMPD3 were also significantly increased in the high compared with normal LFAT group.Adipose tissue is infiltrated with macrophages, and its content of long-chain triacylglycerols and ceramides is increased in subjects with increased LFAT compared with equally obese subjects with normal LFAT content. Ceramides or their metabolites could contribute to adverse effects of long-chain fatty acids on insulin resistance and inflammation.

Bile acids (BA) participate in the maintenance of metabolic homeostasis acting through different signaling pathways. The nuclear BA receptor farnesoid X receptor (FXR) regulates pathways in BA, lipid, glucose, and energy metabolism, which become dysregulated in obesity. However, the role of FXR in obesity and associated complications, such as dyslipidemia and insulin resistance, has not been directly assessed.Here, we evaluate the consequences of FXR deficiency on body weight development, lipid metabolism, and insulin resistance in murine models of genetic and diet-induced obesity.FXR deficiency attenuated body weight gain and reduced adipose tissue mass in both models. Surprisingly, glucose homeostasis improved as a result of an enhanced glucose clearance and adipose tissue insulin sensitivity. In contrast, hepatic insulin sensitivity did not change, and liver steatosis aggravated as a result of the repression of β-oxidation genes. In agreement, liver-specific FXR deficiency did not protect from diet-induced obesity and insulin resistance, indicating a role for nonhepatic FXR in the control of glucose homeostasis in obesity. Decreasing elevated plasma BA concentrations in obese FXR-deficient mice by administration of the BA sequestrant colesevelam improved glucose homeostasis in a FXR-dependent manner, indicating that the observed improvements by FXR deficiency are not a result of indirect effects of altered BA metabolism.Overall, FXR deficiency in obesity beneficially affects body weight development and glucose homeostasis.

Identification of early mechanisms that may lead from obesity towards complications such as metabolic syndrome is of great interest. Here we performed lipidomic analyses of adipose tissue in twin pairs discordant for obesity but still metabolically compensated. In parallel we studied more evolved states of obesity by investigating a separated set of individuals considered to be morbidly obese. Despite lower dietary polyunsaturated fatty acid intake, the obese twin individuals had increased proportions of palmitoleic and arachidonic acids in their adipose tissue, including increased levels of ethanolamine plasmalogens containing arachidonic acid. Information gathered from these experimental groups was used for molecular dynamics simulations of lipid bilayers combined with dependency network analysis of combined clinical, lipidomics, and gene expression data. The simulations suggested that the observed lipid remodeling maintains the biophysical properties of lipid membranes, at the price, however, of increasing their vulnerability to inflammation. Conversely, in morbidly obese subjects, the proportion of plasmalogens containing arachidonic acid in the adipose tissue was markedly decreased. We also show by in vitro Elovl6 knockdown that the lipid network regulating the observed remodeling may be amenable to genetic modulation. Together, our novel approach suggests a physiological mechanism by which adaptation of adipocyte membranes to adipose tissue expansion associates with positive energy balance, potentially leading to higher vulnerability to inflammation in acquired obesity. Further studies will be needed to determine the cause of this effect.

Fluoropyrimidines are the first-line treatment for colorectal cancer, but their efficacy is highly variable between patients. We queried whether gut microbes, a known source of inter-individual variability, impacted drug efficacy. Combining two tractable genetic models, the bacterium E. coli and the nematode C. elegans, we performed three-way high-throughput screens that unraveled the complexity underlying host-microbe-drug interactions. We report that microbes can bolster or suppress the effects of fluoropyrimidines through metabolic drug interconversion involving bacterial vitamin B6, B9, and ribonucleotide metabolism. Also, disturbances in bacterial deoxynucleotide pools amplify 5-FU-induced autophagy and cell death in host cells, an effect regulated by the nucleoside diphosphate kinase ndk-1. Our data suggest a two-way bacterial mediation of fluoropyrimidine effects on host metabolism, which contributes to drug efficacy. These findings highlight the potential therapeutic power of manipulating intestinal microbiota to ensure host metabolic health and treat disease.